外源目的基因表达与调控.pptVIP

第六章 外源目的基因表达与调控; 生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。; 外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个重要环节。 基因的转录是在RNA聚合酶的作用下合成mRNA，原核生物mRNA一般不需要转录后加工。 真核生物mRNA在细胞内合成，且需要经过一繁殖加工过程：RNA剪接、5′端加帽、 3′端加上poly(A)尾巴。 原核生物一般没有翻译后加工，真核生物有较复杂的翻译后加工。;第一节 外源基因表达机制;二、mRNA的延伸与稳定性 外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。 为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止，可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。 在表达载体中加入正常转录终止序列，可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，增加外源基因表达的稳定性。;三、外源基因mRNA的有效翻译 外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑： 1. AUG(ATG)是首选的密码子； 2. SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基； 3. SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3~9个碱基； 4. 在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的二级结构。; 真核细胞mRNA的5′非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列含有共同序列。 不同生物使用密码子具有不同的偏好性。如果外源基因的mRNA密码子使用受体的偏好密码子，则表达效率高。 mRNA上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响。在原核细胞中，UAA为最常用的终止密码子。;四、表达蛋白质在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物在宿主细胞中的稳定积累，不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表达量。 避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施: 1.构建融合蛋白表达系统。 2.构建分泌蛋白表达系统。 3.构建包涵体表达系统。 4.选择蛋白酶缺陷型的受体系统。;五、基因沉默 基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素，主要出现在转基因动物和转基因植物中。 目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA相互作用的结果。重复序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一，在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列有较高的同源性。 ;第二节 基因表达的调控元件;二、增强子 增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。 1.双向性。正反两个方向调节活性。 2.重复序列。增强子一般含有能独立行使功能的重复序列。 3.功能与位置无关。 4.特异性。组织特异性，或在特定细胞阶段。 5.对异源基因也有调节功能。;三、终止子 终止子是提供终止信号使RNA聚合酶停止转录的DNA序列。 本征终止子指不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。属于强终止子。 依赖型终止子需要ρ因子的辅助，属于弱终止子。;四、衰减子 衰减子是基因表达调控的精细调节装置，利用原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对基因转录进行地开关式的微调作用，从而保证原核生物在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个本底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。;五、绝缘子 绝缘子长约几百个核苷酸，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子之间的一种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。;六、反义子 反义RNA是一类与特定DNA序列互补的小分子RNA。编码反义RNA的DNA称为反义子。反义RNA广泛存在于原核生物和真核生物中，在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起着调节作用，其中以对蛋白质合成的