荧光定量PCR技术专题ppt参考课件.pptVIP

将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) 原始图谱 对数图谱 SYBR Green I染料法——融解曲线 融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 SYBR Green I染料法——融解曲线 使用方便，不必设计复杂 探针 具有价格优势 优 点 无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低 缺 点 SYBR Green I染料法——优缺点 Taqman探针法——原理 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 Taqman探针法——工作机理 热变性 引物和探针与模板退火 延伸反应 探针 报告基团 淬灭基团 探针 DNA聚合酶 引物 R R R R 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同 Taqman探针法——PCR体系的建立 高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点 Taqman探针法——优缺点 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素 淬灭剂 实时荧光定量PCR的分类－－分子信标 FRET 实时荧光定量PCR的分类－－分子信标 高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低 优 点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高 缺 点 实时荧光定量PCR的分类－－分子信标 几种方法的应用比较 方法 优点 缺点 适用范围 SYBR Green I 方法 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求高 易出现非特异性带 适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究 TaqMan 方法 特异性高 重复性好 价格高 只适合特定目标 病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断 Molecular Beacon法 (分子信标) 高特异性 荧光 背景低 只适合特定目标 设计困难 价格高 特定基因分析 SNP分析 定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，  GMO定量检测等 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认， 差异显示结果验证等 荧光定量PCR技术的应用 内容概要 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南 绝对定量解析方法 Sample 25 绝对定量的定义 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。 绝对定量分析几要素 质粒标准品的制备 PCR 目的基因克隆 质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 目的基因 基因组DNA 拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（cop