氯氨酮对大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡和Fas蛋白、Bcl.docxVIP

氯氨酮对大鼠心肌缺血再灌注心肌 细胞凋亡和Fas蛋白、Bcl 【关键词】心肌缺血再灌注损伤；心 肌细胞凋亡；氯胺酮；Fas蛋白；Bcl 摘要：目的：探讨氯胺酮作用下大鼠 实验性心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡与 Fas及Bcl2蛋白表达的变化及与心肌组织 损伤的关系，并分析心肌组织病理学损伤程 度。方法：以穿线结扎或松扎左冠状动脉制 备大鼠心肌缺血再灌注模型。32只大鼠随 机分成假手术组（假手术h）、缺血再灌注 组（缺血30min、再灌注4 h）、低剂量氯胺 酮+缺血再灌注组（缺血30min、再灌注4h） 及高剂量氯胺酮+缺血再灌注组（缺血30min、 再灌注个4 h）。以缺口末端标记法检测心 肌细胞凋亡的变化,SP免疫组化法分别检 测Fas与Bcl2蛋白水平变化，做病理组织 切片检查心肌损伤情况。 结果：心肌缺血 再灌注后心肌细胞凋亡指数及 Fas蛋白阳 性染色指数与Bcl2蛋白阳性染色指数均增 加，氯氨酮可减少心肌凋亡，减少 Fas和 Bcl2蛋白阳性细胞表达；心肌缺血再灌注后 心肌组织呈大小不一的灶性坏死,坏死周围 有炎性细胞浸润，氯胺酮作用后坏死减轻， 低剂量氯胺酮作用更明显。结论：心肌缺血 再灌注时心肌细胞凋亡、Fas基因的蛋白与 Bcl2蛋白表达量均增加,氯氨酮可减少心 肌凋亡，减少细胞Fas和Bcl2蛋白阳性表达 从而减轻心肌损伤，且低剂量氯氨酮作用更 明显。 关键词： 心肌缺血再灌注损伤； 心肌 细胞凋亡； 氯胺酮；Fas蛋白；Bcl2蛋 白 细胞凋亡不同于细胞坏死的另一种细 胞死亡形式，它是一个受遗传基因调节的 生理学细胞自杀过程或程序性细胞死亡 ：1］。研究表明在心肌缺血再灌注过程时， 大量氧自由基生成、细胞内钙超载、大量中 性粒细胞浸润以及线粒体损伤等均可促进 心肌细胞凋亡，造成心肌损伤。而细胞凋亡 中，凋亡刺激基因的蛋白表达产物 Fas蛋白 及抗凋亡因子Bcl2蛋白的作用被认为中有 重要意义。有研究表明氯胺酮可抑制心肌缺 血再灌注损伤，但对其是否抑制心肌中的细 胞凋亡并不清楚。本实验研究氯胺酮对其作 用下大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡 与Fas及Bcl2蛋白表达量的变化及与心肌 组织损伤的关系。 1材料与方法 11实验材料与仪器小型动物呼吸机 （浙江大学实验仪器厂）,心电图检测仪（浙 江大学实验仪器厂）。细胞凋亡原位检测试 剂盒（In Situ Cell Death Detection Kit , POD购自 Boehringer Mannheim 公司，兔抗 鼠Fas多克隆抗体及FasL多克隆抗体均购 自Santa Cruz公司。SABC式剂盒购自于博 士德公司。 12实验动物及分组雄性健康 S扶鼠32 只，由长江大学医学院实验动物中心提供 ， 体重250~300g,随机分为4组，每组8只。 A组为假手术对照组；B组为缺血再灌注模 型对照组；C组为2mg/kg氯胺酮+缺血再灌 注模型组;D组为4mg/kg氯胺酮+缺血再灌注 组。 13动物模型制备10咻合氯醛40mg/kg 腹腔注射麻醉，连接多功能监护仪记录n导 心电图；气管切开，接小型动物呼吸机进行 机械通气，呼吸频率 60次/分，潮气量 2ml/100g ,于左胸第四肋间打开胸腔暴露心 脏，在左心耳1mn^冠状动脉处，用眼科外 用不锈小圆针穿过心肌浅层， 稳定10min后 将U型含有铜丝的胶管置于冠状动脉表面一 起结扎；结扎开始左心室心尖部即由红色变 暗，30min后呈暗红色，心电图中出现ST段 抬高，说明缺血形成。此时 B、C、D组分别 由右腹股静脉注入10mL/kg生理盐水、 2mg/kg氯胺酮、4mg/kg氯胺酮，解开结扎线 后进行再灌注。在再灌注 4h后断头处死， 将新鲜心肌组织标本放入 40 g/L中性甲醛 溶液中固定，然后集中进行石蜡包埋，切 片于4C冰箱保存备用。 14凋亡细胞原位标记与半定量分析石 蜡包埋的心肌组织,采用末端脱氧核昔酸转 移酶（TdT酶）介导的带荧光的dU TP缺口 末端标记法检测。结果根据凋亡阳性细胞分 布情况，每张切片拍摄5个阳性视野，每视 野记数300个心肌细胞中阳性细胞数，以 平均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡 细胞阳性指数(AI)。 15 Fas基因和Bcl2基因蛋白表达检测 与半定量分析取上述石蜡标本相应部位的 连续切片各5张，采用链霉亲和素生物素过 氧化酶复合物技术(SABC)法进行免疫组化 染色和HRP/ AEC显色法。每张切片于阳性 表达区域选择10个无重叠视野，用图像分 析仪进行分析，并计算其光密度值的均值。 采用光密度值的均值X 102表示。 16心肌组织病理学分析切片于 HE染 色后观察其组织病理性损伤改变。 17统计学处理采用SPS辙件进行统计 学分析，多组间比较用单因素方差分析，q检 验