大肠杆菌检查法.docVIP

深圳康林生物科技有限公司 题目 大肠杆菌检查法 文件编号 SOP- 页 数 PAGE 8 / NUMPAGES 8 深圳康林生物科技有限公司 大肠杆菌检查法 颁发部门：质量管理部 编号： SOP- 页数： PAGE 1 / NUMPAGES 8 制定人 审核人 批准人 分发部门：检验科 年 月 日 年 月 日 年 月 日 生效日期 年 月 日 目的： 建立大肠杆菌检查法的标准操作程序，规范二大肠杆菌检查法的操作 范围： 适用于大肠杆菌检查法 职责： 检验科主管、检验员 规程： 1 简述 大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichia coli），为肠杆菌科埃希菌属的模式种，埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等四个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体，大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌，可引起婴幼儿，成人爆发性腹泻，为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌。 用4-甲基伞形酮葡萄苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，即MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠杆菌是一项新技术，其检验步聚为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG，Indole试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与Indole试验不一致时，则需分离培养，革兰染色，镜检及生化试验鉴别。 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明96%的大肠杆菌含β－葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD），约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6%，鉴于98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG-靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99%。 2 仪器、设备及用具 2.1 无菌室［参照细菌，霉菌(酵母菌)计数2.1.1］。 2.2 净化工作台. 2.3 恒温培养箱(36±1℃) 2.4 高压蒸汽灭菌器 2.5 显微镜(1500×) 2.6 微波炉或其他适宜加热装置 2.7 水浴箱45±1℃ 2.8 离心机(500～4000/min) 2.9 薄膜过滤装置 微孔滤膜 直径约50mm，孔径0.45±0.02μm 3.0 电冰箱 3.1 匀浆仪 3.2 366nm紫外灯 3.3 玻璃器皿［参照细菌，霉菌(酵母菌)计数2.2.2］ 3 试液 指示液 3.1 0.9%无菌氯化钠溶液 ［附录3.1］ 3.2 无菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2) ［附录3.3］ 3.3 无菌对氨基苯甲酸溶液 ［附录2.2］ 3.4 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液 ［附录3.2］ 3.5 欧-波(Ehrlich-Boehme)试液 ［附录2.17］ 3.6 甲基红试液 ［附录4.2］ 3.7 V-P试液 ［附录2.11，2.13］ 3.8 革兰染色液 ［附录2.4，2.10，2.16］ 3.9 中性红指示液 ［附录4.1］ 3.10 亚甲蓝指示液 ［附录4.3］ 3.11 溴麝香草酚蓝指示液 ［附录4.6］ 3.12 酸性品红指示液 ［附录4.7］ 3.13 曙红钠指示液 ［附录4.9］ 4 培养基 4.1 营养肉汤 ［附录5.1］ 4.2 营养琼脂 ［附录5.2］ 4.3 胆盐乳糖(BL)培养基 ［附录5.6］ 4.4