分子生物学实验课件 2质粒DNA的提取.pptVIP

2015年4月 课件作者：蒋华云 实验二、质粒DNA的提取 碱裂解法提取质粒的原理 重悬（溶液Ⅰ，pH8.0） 变性（溶液Ⅱ）→pH12.0 复性（溶液Ⅲ,pH4.8）→中性 离心——沉淀（取上清）——去杂——留沉淀 提取质粒的操作步骤 取1.5mL菌液，4000r/min，2min，收集细菌沉淀 溶液Ⅰ：溶液Ⅱ：溶液Ⅲ＝100uL：200uL：150uL 1：2:1.5(体积比) Tris饱和酚：氯仿=1:1（估计上清液体积） 等体积，去蛋白质和脂质 两倍体积无水乙醇沉淀质粒DNA 70%乙醇洗涤质粒DNA，空气干燥。 无菌水（ddH2O）(含RNase A)溶解质粒DNA -20℃低温保存 板书 实验目的 学习碱裂解法提取质粒原理和操作技术。 实验原理 碱裂解法提取质粒 操作步骤 操作步骤（板书） 将25mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基加入100mL锥形瓶中，接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 收菌，吸取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中，4000r/min室温离心2min。 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10min。 加入200μL溶液Ⅱ(新鲜配制)，盖紧盖子，混匀内容物，将离心管放冰上5min。 加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷)，盖紧盖子，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。 12000r/min离心15min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚:氯仿（1:1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。 12000r/min离心5min，倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡，12000r/min离心5min，倒去上清液，空气干燥。 加20μL纯水(含20μg/mL胰RNA酶)，使质粒DNA完全溶解，－20℃保存。 注：1mL纯水中加2μL10mg/mL的胰RNA酶配制成溶解质粒的纯水。 在下次实验中观察实验结果，通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA。 每班1个冻存盒，标记如：周二413下午，质粒样品编号：学号 * 温故而知新 试剂耗材的准备 溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、酚：氯仿、无水乙醇、70%乙醇、无菌水 实验流程 质粒DNA的提取→鉴定→双酶切 PCR→鉴定并纯化产物 纯化产物（重组与测序） 感受态制备→DNA重组转化 2012-3 课件作者：蒋华云 * 质粒(载体) 质粒是基因工程中常用的载体之一。质粒是染色体外小型双链环状的DNA，大小在1～200kb之间。 基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体，主要有大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒等。载体的结构包括抗性基因、起始复制子、多克隆位点和标记基因。 作为基因工程用的载体必须具备以下条件： 复制子 有一个或多个利于检测的遗传表型 有一到几个限制性内切酶的单一识别位点 适当的拷贝数 2012-3 课件作者：蒋华云 * 操作注意事项 操作要点 “轻轻摇匀” “新鲜配制” “冰上预冷” “沉淀”与“上清” 仪器的正确使用 移液器 离心机 2012-3 课件作者：蒋华云 * 保存 -20℃低温冰箱保存（每实验小班一个冻存盒，做好详细标记） 保存于411准备间低温冰箱 2012-3 课件作者：蒋华云 * 思考题 碱裂解法提取质粒的原理是什么？ 本实验中酚：氯仿的作用是什么？ 溶解质粒DNA时加入胰RNA酶的作用是什么？ 正确使用移液枪的要点有哪些？ ？ 溶液Ⅰ 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力作用而降解 EDTA：螯合Mg2+、Ca2+ 等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用。另外，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4-糖苷键，因而具有溶菌作用 溶液Ⅱ NaOH：DNA在pH大于5、小于9的溶液中是稳定的。但当pH﹥12或pH﹤3时，就会引起双链之间的氢键解离而变性。溶液II中的NaOH浓度为400mmol/L，加到提取液中时，该系统的pH12，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性 SDS：SDS是离子型表面活性剂。其主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白，因而溶解膜蛋白破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合使蛋白质变性而沉淀下来 溶液Ⅲ 该溶液实际上是KAc-HAc的缓冲液 用pH4.8的KAc是为了把强碱性的提取液调回至pH中性，使变性的质粒DNA能够复性，并稳定存在 高盐的5mo