分子生物学实验课件 3琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA.pptVIP

201504 课件作者:蒋华云 * * 实验三、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 你提取的质粒DNA怎么样？ 准备→配试剂→提取质粒DNA 是否提取到质粒DNA？ 质粒DNA质量怎么样？ 实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 确定后续实验材料 2012-3-13 课件作者：蒋华云 * 电泳原理 带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。 凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法。 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。 样品的物理性状（分子大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型） 支持物介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶） 电场强度 缓冲液离子强度（最适离子强度一般在0.02～0.2之间） 2012-3-13 课件作者：蒋华云 * DNA分子在琼脂糖凝胶中 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动 在一定的电场强度下， DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子 2012-3-13 课件作者：蒋华云 * 不同构型的质粒DNA 超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA，简称CCCDNA） 开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA一条链断裂（open circular DNA，简称OCDNA） 线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA二条链断裂（linear DNA，简称L DNA） 2012-3-13 课件作者：蒋华云 * 实验仪器 分析天平 微波炉（电炉） 移液器（10uL） 琼脂糖凝胶电泳系统（水平槽） 紫外线透射仪（或凝胶成像系统） 2012-3-13 课件作者：蒋华云 * 琼脂糖凝胶电泳系统（水平槽） 水平槽电泳系统的使用 缓冲液 染料指示剂 琼脂糖凝胶 电泳仪 电泳正在进行 电泳仪 DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。 点样端靠近负极 DNA分子在凝胶中移动 材料与试剂 质粒DNA DNA marker 2000 DNA marker 10000 1×TAE(电泳缓冲液) 6×凝胶加样缓冲液 琼脂糖 1%溴化乙锭溶液（EB） （注意： EB 具有毒性，戴手套操作） 实验操作步骤 胶板的制备 制备1%琼脂糖凝胶 加样 记录点样的顺序和点样量 电泳 DNA的迁移速度和电压成正比，最高的电压不超过5V/cm， DNA片段从负极向正极移动，当溴酚蓝指示剂移动到距凝胶前沿1～2cm处时，停止电泳。 90V恒压电泳25min 实验报告 请详细记录实验过程 * * * * 带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法。 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比。与样品的分子大小、介质粘度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率。 影响泳动率的因素：样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度。影响泳动率的首要因素是电泳样品的物理性状，包括分子大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型。DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子；聚丙烯酰胺凝胶可以分离小片段（5～500bp）DNA。常采用Tris·醋酸（TAE）、Tris·硼酸（TBE）和Tris·磷酸（TPE）3种缓冲体系。电泳的最适离子强度一般在0.02～0.2之间。 下面介绍常用的两种不同支持物介质的电泳。 （1）琼脂糖凝胶电泳 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下， DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 具有不同相对分子量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如质粒DNA分子有3种构型，即超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalent