医学细胞生物学：第三章 细胞生物学的研究方法.pptVIP

Example of an approximately 40,000 probe spotted oligo microarray with enlarged inset to show detail. 五. 蛋白质组学研究技术 Mass spectrometry（质谱） 第六节 生物大分子的结构测定 一. 核磁共振技术 核磁共振光谱仪（nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) 二. X-射线衍射技术 小结： 观察细胞的手段与方法 细胞组分分离的方法 蛋白质分离纯化与鉴定的方法(柱层析，电泳，等） 分子生物学的方法 DNA 操作（PCR， Southern blot，in situ hybridization) RNA 应用(RT-PCR, Northern blot, siRNA) Protein over-expression in a cell 细胞培养及细胞分离 细胞内分子定位： 酶细胞化学技术 免疫化学技术 放射自显影 细胞内分子示踪 离子探针 GFP FRET transformation Transfections(3种） infection 蛋白质相互作用的研究技术 Co-IP Yeast two-hybridization 其它（FRET） 生物芯片技术cDNA microarray 蛋白质组学Mass spectrometry 生物大分子的结构测定 Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR X-ray diffraction （二）不同支持物的电泳分离不同 大小的DNA分子 （常规的分子生物学技术之二） （三）聚合酶链式反应对特定的DNA序列进行复制 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR) DNA RNA mRNA tRNA rRNA Protein Replication Transcription Translation Reversed transcription DNA in vitro amplification (PCR) The discovery of Taq enzyme. Taq DNA polymerase is a thermostable DNA polymerase that prossesses a 5’- 3’polymerase activity and a Double strand specific 5’-3’ exonuclease activity. 94C 1’94C 30’’55C 1’72C X mins72C 10min 30 cycles （常规的分子生物学技术之三） （四）DNA文库和基因克隆是实验室常用的工具与方法 Genomic DNA library Plasmid, cosmid cDNA library （五）测定DNA序列的基本方法是双脱氧链末端合成终止法 DNA序列测定的条件：1. 能分辨一个碱基差别的单链DNA 2. 形成一系列的单链DNA(DNA polymerase) 英国人 Sanger ATCGGGCCAATTCCTA ATCGGGCCAATTCCT ATCGGGCCAATTCC ATCGGGCCAATTC ATCGGGCCAATT ATCGGGCCAAT ATCGGGCCAA ATCGGGCCAATTCCTA ATCGGGCCA 引物 模板 A G C P-o-P- Deoxyguanine5’-triphosphate (dGTP) (A uncleotide) DNA polymerase 2. DNA sequencing H Dideoxyguanine 5’-triphosphate (ddGTP) C G T A 反应体系中的底物多为dNTP, 少量ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP （六）核酸分子杂交用于检测组 织或细胞中的互补序列 1. 原位杂交（in situ hybridization, ISH) 核酸杂交的概念 用于杂交的探针是体外 合成的带有标记的DNA片段 2. Southern blot：用于检测DNA的方法 (现在多被PCR取代） 3. Northern blot ：用于检测mRNA水平的方法(现在多被RT-PCR取代） 可以用PCR技术结合DNA序列分析来确定基因的存在甚至拷贝数的多少。 （七）向细胞内导入分子的方法 1.脂质体法（转染） 2.电转移法 （转染） 3. 显微注射（转染） 4.病毒感染法 （七）向细胞内导入分子的方法 1.脂质体法（转染） 2.电转移法 （转染） 3. 显微