生物技术制药：4-抗体工程制药-1.pptVIP

-d 细胞融合 -a -b -c -d Ag X Ag X’ ELISA HAT PEG Cell fusion Hybridoma cells 融合瘤细胞 （Subcloning） (确定只有一种细胞) d’ d a b c d a b c d’ + + + + + + + - X -d -c -b -a + - -d NS-1 骨 髓 癌 细 胞 B cell 脾 细 胞 分株培养筛选 筛选 单抗 传统抗体 (抗血清) 试验专一性 对 抗 原 的 反 应 无 法 分 辨 完 全 不 同 d 旧有抗原 d’ 新的抗原 单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题？ 单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应 异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，产生人抗鼠抗体（HAMA），导致异源性超敏反应 至2003年再没有新的鼠源抗体药物进入临床研究 多价抗原 单克隆 （致敏的B细胞） 单克隆抗体 单克隆抗体 基本原理 细胞工程抗体----杂交瘤----单克隆抗体 （2）多克隆抗体 (Polyclonal antibody) （2－1）概念 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体. （2－2 ）实验室制备多克隆抗体 研究、诊断用 所用动物：1 Balb/c小鼠，6－8周龄；雄性 2 大鼠 3 兔子生后约12周。 抗原：1 纯化的抗原（线性抗原或构型抗原） 2 非纯化抗原 技术关键：抗原制备 应用：免疫学检测 抗血清 抗 原 免 疫 所有抗体混合 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 B 細胞 （2－3）制备多克隆抗体药物 －紧急被动免疫和及紧急预防 1 2 3 4 马血清 抗原 （破伤风毒素） 破伤风抗毒素血清 一头成年马反复采血可获得10000 ml以上的抗血清 类毒素 毒素 马血清 抗毒素 超敏反应 抗体 抗原 马血清抗毒素的两重性： (1) 特异性抗体----中和毒素 (2) 异种抗原，可刺激机体产生抗马血清抗体 马血清具有立即提供保护的优势，但异种gamma-球蛋白只是短期有效，常常导致病理合并症（血清病）和过敏反应。 人源多克隆抗体－血液制品 人的gamma-球蛋白是最理想的(同源性免疫球蛋白) ，但具有传播肝炎和爱滋病的风险。 献血员免疫（白喉毒素、狂犬病疫苗等） 少量采血测效价 大量采血 制备抗体 是 （3）单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb) （3－1）概念: 通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体. 特点:单一特异;可重复;大量供应 不需纯抗原;灵敏度高 骨髓瘤细胞 致敏的B淋巴细胞 杂交瘤 HAT: 次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 (3-2)、抗原与动物免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 不需纯化; 化学合成或者提纯 微生物或细胞可直接作为抗原 免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠 Balb/c小鼠，8-12周龄；雄性 动物与骨髓瘤同品系 P183页 佐剂:弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂 免疫方法： 体内免疫:免疫原性强,抗原量多. 皮下注射,腹腔注射免疫 体外免疫:不能用体内免疫的 杂交瘤细胞株不稳定 初步免疫和加强免疫 测定抗体效价 处死小鼠,去脾细胞 基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释 。 其他融合方法:电融合等 细胞：骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 (HGPRT)缺陷型）应和免疫动物属于同一品系，这样杂交率高。 （3－3）免疫及细胞融合 饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。 用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点 癌细胞 可培养生长 浆细胞 B cell 可分泌抗体 融合瘤 Hybridoma Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 细 胞 融 合 两组染色体混在一起 也可以培养生长 产生专一性抗体 一个 B cell 只 产生