生物技术制药：2-基因工程制药-2.pptVIP

二、基因重组蛋白的分离纯化与分析鉴定(自学） 基因重组蛋白的特点 (1) 目的产物在初始原料中的含量较低; (2) 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大； (3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性； （4）种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质； （5）应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。 分离纯化的基本过程 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。 分离纯化技术要求： (1)技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； (2)选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数； (3)收率要高； (4)两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤； (5)整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。 （一）基因重组蛋白的主要分离技术 1.离心 在转子的高速旋转产生的离心力的作用下，利用固体及液体间的密度差来实现分离； 往往是分离的第一个步骤 2.沉淀 在制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1.盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2.有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3.等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 等电点沉淀法 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调pH8.0去除碱性蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白质。 盐析法 定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高的这种现象称为盐溶(salting in), 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析(salting out) 原理： salting in：蛋白质吸附某种离子→蛋白质彼此排斥，而蛋白质与水相互作用加强→溶解度提高 salting out：大量中性盐加入 →破坏蛋白质分子表面的水活膜，蛋白质表面的电荷被中和→蛋白质相互集聚而析出 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱 几种盐的盐析能力的排列次序： 磷酸钾硫酸钠磷酸铵柠檬酸钠硫酸镁。 最常用的硫酸铵，由于其在水中溶解度大，利于盐析 膜分离 膜分离法是用天然或人工合成的高分子薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法 膜分离过滤原理：膜是两个或多个浓度相之间具有选择性的分离屏障，采用错流过滤分离方式，利用膜材料选择性分离功能对组分进行分离、纯化； 错流方式可有效降低膜污染及防止浓差极化现象，系统连续操作。 渗透和透析 渗透是一个扩散过程，利用膜的两侧渗透压差使溶剂产生流动。 透析是利用膜两侧的浓度差为驱动力，从溶液中分离出小分子物质的过程。 如：医疗上用于处理肾功能衰竭病人。 透析 反渗透、超滤和微滤 从溶液中分离出溶剂的膜分离操作为反渗透；分离溶液中微粒和大分子的膜分离操作为超滤；使不溶物浓缩过滤的操作为微滤。 反渗透：外加压力差大于渗透压，使溶剂倒流，从而使高浓度溶液进一步浓缩。 反渗透 反渗透、超滤和微滤的孔径范围 电渗透 在电位差的驱动下，用离子交换膜从溶液中分离离子的过程。 主要用于溶液中的蛋白与离子分离，达到脱盐的目的。 4.双水相萃取 双水相萃取技术(Two-aqueous phase extraction,简称ATPS) 是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相,由于被分离物在两相中分配不同,便可实现分离。 双水相的形成 如两种聚合物间存在强的吸引力，则它们结合后存在于一相中；如两种聚合物间有斥力，即某种分子倾向与在它周围的分子是同种分子而不是异种分子，达到平衡后会形成两相。 常用聚合物系统： 聚乙二醇/葡聚糖系统 聚乙二醇/无机盐系统 双水相萃取基本原理 （二）基因重组蛋白的主要纯化技术 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术分为： Ion exchange chromatography (