生物技术制药：2-基因工程制药-1.pptVIP

* * * * 2.昆虫细胞表达系统 杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。Sf9、sf21细胞 昆虫细胞表达系统的优点： 可表达较大的外源基因 可表达不同生物来源的外源基因 与高等生物相似的转录后加工、修饰 杆状病毒具有高度宿主专一性 昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。 * * 3.哺乳动物细胞表达系统 由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。 但利用哺乳动物细胞表达系统表达外源蛋白，其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。 * * * * 将外源基因导入哺乳动物细胞的方法 ： 感染性病毒颗粒感染宿主细胞 通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。 哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞 CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。 * * 二、真核细胞表达制品的安全性的问题 由真核细胞生产的产品可能存在 与肿瘤相关的DNA 病毒DNA尤其是逆转录病毒 我国目前规定：每剂量的药物所含DNA不得大于100pg。 * * * Xho I Not I Xho I MEKK1 1200bp Promoter 400bp pUC-mT 2700bp Colony 1 2 3 1 3100bp 1200bp 400bp 2700bp Xho I cutting Xho I + Not I cutting 1200bp pUC-mT/pLMP1-MEKK1 4300bp 实例 * * 4.DNA序列测定 为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。 * * 5.目的基因表达产物测定法 例：免疫斑点测定法 如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。 此法实验操作极似菌落(或噬菌斑)原位杂交。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。 如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影；若加入的抗体用酶偶联(酶标)，那么此酶就可将无色底物水解成有色产物。 * * 基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文库 限制性内切酶 有切口的载体 有切口的目的基因 DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法 目的基因的表达 * * 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 * * （七）原核细胞表达的特点及选择 外源基因表达的调控元件 启动子: 是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列 plac启动子: 最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子 ptrc启动子: 是trp启动子和lac启动子的拼合启动子 λPL:λ噬菌体的转录启动子PL,该启动子受控于λ噬菌体cI基因产物 T7启动子: 是当今大肠杆菌表达系统的主流 * * 核糖体结合位点(rbs): 原核微生物的 mRNA 结合核糖体的序列称为 SD 序列(shine-dalgarno sequence) 。 SD序列位于AUG上游3-11个核苷酸处的一段3-9个碱基的DNA序列,该序列和核糖体蛋白S1与16S rRNA的3′端互补，形成核糖体-mRNA复合体，共同起始蛋白质的合成。 SD 序列与AUC之间的距离可直接影响表达效率。 终止子： 是基因3‘端可被RNA聚合酶识别并停止转录功能的特定序列。 * * 2.外源基因在大肠杆菌中的表达形式 大肠杆菌被内膜、外膜分隔为胞内、周质、胞外三个区域 表达可定位于胞内、周质、胞外 胞内表达率高，但易行成包涵体 * * 胞内表达的两种方式 非融合蛋白的胞内表达 表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子-细菌的RBS-真核基因的AUG-结构基因-*。 易被蛋白酶破坏； N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应 Stop ATG SD P 目的基因 * * 非融合型表达载体 P SD Foreign DNA 非融合型表达载体 非融合基因 主要元件：强启动子，SD， ATG：第一个密码子 ATG P SD TAA MCS * * * * 融合型表达载体 P SD Foreign D