生物技术制药：3-动物细胞工程制药-2.pptVIP

　转基因动物 一、转基因动物的产生和发展 转基因动物(transgenic animal）:通过基因工程技术将外源DNA导入动物生殖细胞，干细胞，早期胚胎，并在染色体上整合，稳定传给子代的技术，转基因技术诱导基因组改变的动物称转基因动物 1974年Jaenisch等获得含有SV40 DNA的嵌合体小鼠。 1980年，Gordon应用显微注射法首次成功地将重组的外源DNA直接注入小鼠受精卵雄原核中，获得了携带外源基因小鼠。 1982，Palmiter将大鼠的生长激素基因用微注射方法导入小鼠的受精卵中获得巨型小鼠（supermouse），从而在理论上和实践意义上都将转基因技术提高一步，引起生物学界极大的关注，为基因工程育种提供诱人的前景。 二、转基因动物技术的原理和方法 （一）基本原理 体外构建的重组DNA分子通过显微注射，病毒载体转移，胚胎干细胞转染等方法注入动物的受精卵或床前的胚胎细胞，然后将此受精卵或胚胎细胞植入子宫，使其发育成携带外源基因的转基因动物 （二）外源目的基因转入动物的早期胚胎方法 1.显微注射法 在光学显微镜下，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。 2.反转录病毒感染法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的）获得转基因动物的方法． 在培育转基因禽类研究中有广泛应用，是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法，主要集中在鸡的良种培育及抗病毒感染研究方面。 （1）反转录病毒基因 （3）包装细胞 在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒； 病毒包装细胞：染色体除整合序列的整个病毒基因组，为重组蛋白载体转录的RNA提供包装蛋白 病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。 （4）通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 利用反转录病毒DNA的LTR区域具有转录启动子的特点，外源基因随病毒RNA转录，并在载体上 序列的作用下，重组病毒转录的RNA和包装细胞提供的包装蛋白就可以组装成有感染性的病毒颗粒 病毒收获后感染早期胚胎或直接感染受精卵。 或构建好的DNA注射入囊胚腔中和重组病毒及辅助病毒共培养进行转染 3.胚胎干细胞方法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。 含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。 可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。 胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。 猪的胚胎干细胞克隆系， 牛的胚胎干细胞。 ES细胞成为个体 1.将ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体转基因动物。 2.通过核移植将ES导入去核的卵母细胞，在子宫种植发育成个体 胚胎干细胞转基因过程 5.移植 优点：整合率高 同源重组实现定点整合，而非随机整合 缺点：不容易建立胚胎干细胞系 长期培养，导入外源基因的胚胎干细胞会由于细胞分化使生产的动物成为嵌合体 第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长 4.精子载体导入法 将外源DNA与破坏细胞膜的精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入受精卵。 意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。 改进的方法是精子头部纤维注射 此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不少繁杂的操作和条件准备。 但该法有些结果不稳定，不能重复,外源DNA分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能 需在继续改进 5.基因打靶 (gene targeting) 包括基因敲除(Knock-out)：靶基因被灭活. 无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活. 基因敲入(Knock-in):引入不存在的新基因. 将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达， 基因替代：基因修正(gene repairment) 基因敲除的技术路线如下： （1）构建重组基因载体﹔ （2）打靶载体导入ES细胞：重组置换 （3）基因敲除ES细胞注射入胚泡 （4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中 （5）嵌合体的杂交育种 6. YAC (Yeast Artificial Chromosome)人工酵母染色体法 transfer large gene/cluster gene (100kb):YAC具有自主复制序列、