生物技术制药：4-抗体工程制药-2.pptVIP

第四节 基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 概念：采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。 目的：一是降低免疫源性； 二是降低相对分子量， 三增加组织通透性。 一、单克隆抗体人源化(humanized antibody) 降低ＨＡＭＡ反应 　人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。 （1）嵌合抗体(chimeric antibody) 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。人源化程度达到70%左右 1984年出现嵌合重组技术，1994年批准第一个嵌合抗体药物上市，至今总数已达6个如：rituxan , simulect ,remicade 可变区基因的获得 杂交瘤细胞　　　　mRNA分离 cDNA RT PCR VH或VL基因 克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 现临床应用的嵌合抗体 Rituxan (美罗华,利妥昔单抗 ) :?第一个人源化单抗，针对CD20的人/鼠嵌合单抗，含人IgG1κ恒定区,用于治疗低度恶性B 淋巴瘤; 抗淋巴瘤作用主要可能来自于补体作用、ADCC和诱导肿瘤细胞凋亡 为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们又将鼠抗体V区（H、L链）中的3个超变区基因插入人抗体的V区的框架（FR）基因中，这样构建的抗体保留了鼠抗体与抗原结合的特异性。这种抗体几乎百分之百人源化了。 异源单抗上六个CDR通过PCR等方法克隆到人抗体相应的框架区(FR) 上构建成新抗体 经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，到现在已有数百种人源化抗体。 人源性可达90%以上 现在以及未来几年，人源化抗体药物将占有主体地位。 目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法 问题 改型单抗亲和力仅为原来鼠抗体的亲和力的1/40 亲和力下降，亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素 人Ig分子的框架区一些氨基酸与鼠Ig的CDR区不协调 三维蛋白结构等需进一步丰富 已上市人源化改型抗体 1997年美国批准第一个人源化抗体药物上市，如今总数已达10个，占上市抗体药物总数的50%，如 曲妥珠单抗 (Trastuzum):重组DNA人单克隆抗体,选择性作用于HER－2 贝伐珠单抗(Bevacizumab):重组DNA人单克隆抗体,选择性作用于VEGF （4－3）小分子抗体 小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。 基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80-1/3。 小分子抗体有很多优点: 可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。 重组Fab片断是单价的VH-CH（Fd）和轻链的VL-CL两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相同的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简便。细菌表达的Fab与酶解Ig后所获得的Fab具有相同的功能。 Fab抗体易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶 无Fc段，减少了非特异反应和排斥反应 无ADCC和细胞毒CDC 主要作为载体分子用于导向诊断和治疗 １） Fv Fv是由抗体重，轻链的可变区基因(VH、VL)之间通过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开展研究和应用。 其优点是分子量小，易于穿透组织到达靶器官发挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。 1.单价单链抗体（传统单链抗体） 2.单链抗体多聚体 　　linker少于１２个氨基酸，形成多聚体 ３.双特异性单链抗体 　 优点： 　无HAMA反应 　能保持与抗原较高结合的性能， 　分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低，易于穿透 　但linker增加了新的抗原性 　 单链抗体保留了原有单价Fab的抗原结合能力。由于分子量比较小(25 kD)，有利于穿过血管组织定位于肿瘤。 尽管scFv能满足大部分Fv的稳定性，有时scFv单价结合位点结构干扰了其与抗原的结合，Linker结构