基于蛋白质工程的蛋白递送及生物传感平台的构建.pdfVIP

博士学位论文 摘 要 蛋白质是生命体不可或缺的组成成分，各种功能和形态各异的蛋白造就了生 物的多样性与复杂性。丰富的来源与功能的多样性使得蛋白质在科学研究中具有 广阔的应用前景。通过基因工程以及蛋白质工程，不仅可以对天然蛋白的现有功 能进行改造，还可以完成不同功能之间的组合。 蛋白质药物具有高度特异性，极少对正常的生物过程产生干扰和副作用，在 临床领域具有重要的应用价值。针对多数天然蛋白不能穿透细胞膜以及现有的多 肽或蛋白类载体的溶酶体逃逸效率低、缺乏选择性和需要额外化学标记的问题， 开发选择性、高效和免标记的功能蛋白胞内递送载体是十分必要的。由于正常细 胞外微环境呈中性，而一些病变部位如肿瘤等细胞外环境呈微酸性，设计能精确 区分目标微酸性环境与正常生理中性环境的载体有助于提高蛋白药物等对于癌细 胞等目标的选择性，从而获得更好的治疗效果。 点击化学是一种模拟自然界中生物分子连接的方式与策略。由于高效，高选 择性以及模块化反应等特征，点击化学在生物学研究，制药及仿生材料等领域展 现出巨大的应用潜能。大自然中存在大量天然生物分子间位点特异性连接反应， 从这些资源中发掘具有高反应速率和特异性的类点击反应对于生物传感以及材料 组装等领域具有重要意义。 本论文中，我们基于蛋白质工程分别构建了如下蛋白递送载体与生物传感平 台： （1）具有精确目标pH 响应性质的电荷可调型绿色荧光蛋白的设计。超正电 荷绿色荧光蛋白（ScGFP ）具有很强的细胞膜穿透能力和稳定的荧光，且能容忍 一定程度的改造。基于 ScGFP 的穿膜效率与其表面电荷数之间的关系以及组氨酸 的咪唑侧链在不同pH 下的质子化程度差异，我们设想针对不同的目标pH ，用蛋 白表面重构技术对 ScGFP 表面的电荷可调的组氨酸与带恒定正电荷的精氨酸/赖 氨酸的比例进行调节，精确调控 GFP 在不同 pH 下的电荷数，使其具有目标 pH 响应穿膜能力。以癌细胞外微酸性环境（pH ≈ 6.5 ）为目标，设计了His29 GFP 和 His 19GFP 。通过实验，我们发现His29 GFP 在目标微酸性环境下（pH 6.5 ）表现出 很强的穿膜能力，而在正常细胞外微环境下（pH = 7.4 ）不能有效地进入细胞。 此外，His29 GFP 表面的大量组氨酸赋予其强烈的质子海绵效应，使其具有很强的 溶酶体逃逸能力。这些性质使其有望用于生物功能分子的胞内递送以及示踪；同 时，His29 GFP 的出现为设计对目标pH 响应的电荷可调型蛋白提供了很好的示范。 （2 ）目标pH 响应型GFP 用于功能蛋白的胞内递送与示踪。以核糖核酸酶A III 基于蛋白质工程的蛋白递送及生物传感平台的构建 （RNase A ）和单体近红外荧光蛋白（mIFP ）为功能蛋白模型，基于His29 GFP 构 建具有目标pH 响应性质的功能蛋白胞内递送与示踪体系。His29 GFP 成功地在pH 6.5 环境下将两种功能蛋白递送至胞内。被 His29 GFP 递送至胞内的RNase A 大量 地降解胞内的mRNA 并进一步导致细胞死亡。因此，基于目标pH 响应的HisGFP 的递送体系成功地在目标pH 环境下将有生物活性的蛋白递送至胞内；此外，GFP 本身具有的荧光使其能有效地对非荧光的功能蛋白进行追踪。这些特征使得具有 目标pH 选择性的 HisGFP 有望在临床以及成像等领域成为通用化的功能蛋白载 体。 （3 ）Mn2+ 活化的DCV-DNA 类点击反应研究。蛋白与 DNA 的位点特异性的 连接在生理活动的精确调控、材料科学和分析传感等领域具有重要意义。来源于 鸭圆环病毒的复制起始蛋白（DCV ）与含有其识别序列的 DNA 之间的共价连接 在病毒复制等活动中起关键作用。通过克隆表达纯化获得 DCV 蛋白，并对其与 DNA 之间的共价连接反应特性进行研究，我们发现该反应对 Mn2+ 具有很高的选 择性与依赖性；反应在水相环境中进行，2 min 即完成反应，且连接效率高达90% 。