联合用药对水产品中嗜水气单胞菌耐药性的影响研究.pdfVIP

摘 要 世界卫生组织 （WHO ）指出，抗生素耐药性已成为本世纪全球公共卫生和食品安全领域关注 的热点问题，其中水产养殖环境是耐药性出现及传播的重要环节。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila ）具有广泛致病性，是水生动物最常见的致病菌之一，近年来，其也作为新型人类病原 体引起人们广泛关注。研究显示，来自零售市场、超市及餐厅即食海鲜产品中，均可分离出大量 嗜水气单胞菌耐药菌株及其耐药基因。由于新型抗菌药物研发停滞不前，且生物替代疗法成本较 高，不适宜推广应用，因此当前寻求新的方法延长并最大化发挥现有抗生素的临床疗效具有重要 意义。 本论文基于嗜水气单胞菌，分别对12 种常规抗生素及14 种天然活性组分进行药敏试验，了 解嗜水气单胞菌耐药情况并筛选对其有效的天然活性成分，并基于“药物组合+细菌”体系模型， 探究了二元药物组合对嗜水气单胞菌耐药性的影响与规律，以期为水产品中嗜水气单胞菌耐药性 定向风险阻控提供理论依据，主要研究内容与结果如下： (1) 单一抗菌药物对嗜水气单胞菌敏感性研究。基于MIC 法，评价常规抗生素及天然活性组 分对嗜水气单胞菌的敏感性，实验结果显示：甲砜霉素、多西环素、新霉素、恩诺沙星、土霉素、 氟苯尼考、磺胺二甲氧嘧啶以及阿米卡星等8 种常规抗生素，以及柠檬醛、芳樟醇、香叶醇、丁 香酚以及百里香酚等5 种天然活性成分对嗜水气单胞菌具有较好抑制作用；从耐药结果分析，嗜 水气单胞菌总体耐药情况不容乐观，不仅对多种抗生素出现耐药，且中介程度也较高。目前用于 防治嗜水气单胞菌的单一药物可优先选用氟苯尼考，而恩诺沙星、新霉素、阿米卡星可作为水产 养殖中的备选药物。 (2) 联合用药对嗜水气单胞菌耐药性影响及组合筛选研究。基于CI、CA 和IA 模型预测二元 药物组合对嗜水气单胞菌标准菌株的抑制作用，比较模型对联合效应的评估预测精度，结果显示 CI 模型对联合效应拟合度更好，精确度更高；进一步采用CI 模型评估药物组合相互作用，筛选 协同药物组合，并针对5 种野生菌株对所筛选的协同药物组合进行保守性评估。所筛选的药物组 合中有18 对药物在整个效应浓度内均呈协同效应，13 种组合随fa 水平升高，由协同逐渐转变为 拮抗作用；31 种组合随fa 水平升高，由拮抗转向协同；8 对药物组合在整个效应浓度范围内呈完 全拮抗作用。物种内药物相互作用具有高度保守性，且几乎发生在具有相同作用机制的药物组合 之间。但仍存在少数相互作用在特定浓度范围内呈现菌株特异性，如“百里香酚+新霉素”组合在 84 μg/mL~131 μg/mL 时对气单胞菌呈协同作用，而对弧菌呈拮抗； “芳樟醇+多西环素”组合在 69 μg/mL~106 μg/mL 范围内对气单胞菌呈协同作用，对弧菌呈拮抗。 (3) 基于草鱼上皮细胞验证联合用药疗效及其对耐药性阻控的研究。以草鱼上皮细胞为体外 模型，利用成像流式细胞仪动态监测嗜水气单胞菌感染时间对细胞产生的损伤及凋亡变化，研究 显示嗜水气单胞菌以 1：20 的侵染比感染细胞，2~3 h 为细胞损伤关键控制点；结合高内涵筛选 系统（High Content Screening, HCS ）捕获早期毒性指针ROS 、MMP 和Ca2+水平的消长变化及差 异性，验证“新霉素+ 甲砜霉素”, “多西环素+土霉素”，“百里香酚+新霉素”3 种典型药物组 合的疗效。实验结果显示，所筛选的协同药物组合在体外敏感细胞系中也呈显著协同作用，在增 强杀菌疗效的同时，减少了常规抗生素的使用及其在水生环境中的残留。 I 关键词：嗜水气单胞菌，耐药性，联合用药，水产品 II Abstract According to the World Health Organization, antibiotic resistance has become a hot issue in the field of global public health and food safety of this century. Aquaculture environment is an i