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实用标准 elisa 酶联免疫吸附实验报告 一．实验目的 酶联免疫吸附测定 （enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA）是在免疫酶技术 （immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 ,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体 上称为包被， 加待测抗体 （抗原） , 再加相应酶标记抗体 （抗原） , 生成抗原（抗体） －－待测抗体 （抗原） －－酶标记抗体的复合物， 再与该酶的底物反应生成有色产物。 借助分光光度计的光吸收计算抗体 （抗原） 的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶， β －Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸 酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。 常用于 ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶， 碱性磷酸酯酶等， 其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化 作用使颜色加深，无法准确地定量。 文档大全 实用标准 辣根过氧化物酶（ HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（ protonhemin ）区作辅基。酶的浓 度和纯度常以辅基的含量表示。 氯化血红素辅基的最大吸收峰是 403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm， 所以酶的浓度和纯度计算式是（已知 HRP的 A（ 1cm 403nm 1%）＝ 25，式中 1％指 HRP百分浓度为 100ml 含 酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是 HRP的 A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度（ RZ） =A403nm/A275nm纯度 RZ（Ｒ einheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRP的 RZ 值在 3.0 左 右，最高可达 3.4 。用于 ELISA 检测的 HRP的 RZ值要求在 3.0 以上。 ELISA 的基本原理有三条： 1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附， 并保持其免疫学活性； 2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后， 可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且 颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA 法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非 传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为 文档大全 实用标准 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而 且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本 , 因此，也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定 抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA 法在生物医 学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1 、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2 、研究抗酶 抗体的合成。 3 、显现微量的免疫沉淀反应。 4 、定量检测体液中抗原或抗体成份。 基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法 : 1. 包被：用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1～ 10μ g／ ml。在每个聚苯 乙烯板的反应孔中加 0.1ml ， 4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗 3 次，每次 3 分钟。（简称 洗涤，下同）。 2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37℃孵育 1 小时。然后洗涤。 （同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔） 。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度） 0.1ml 。37℃孵育 0.5 ～1 小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB底物溶液 0.1ml ，37℃10～30 分钟。 文档大全 实用标准 5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml 。 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反 应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ +”、“ - ”号表示。也可测 O?D值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm（若以 ABTS显色，则 410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔 O?D值，若大于规定的阴性对照 OD值 的 2.1 倍，即为阳性。