生物化学教学课件：Amino acids and proteins.pptVIP

行使生物学功能的生物大分子“多样的基石” 什么是蛋白？ 鸡蛋白 瘦肉 虾肉 青菜 香菇 黄豆 豆腐 牛奶 豆浆 橙汁 咖啡 可可 可乐 苏打水 * Principle of electrophoresis S: 面积； M：分子量；ρ：电荷密度 * Media of electrophoresis Media: polyacrylamide gel （聚丙烯酰胺凝胶） So called: polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE * 丙烯酰胺 亚甲基（甲叉）双丙烯酰胺 Forming of polyacrylamide gel * 连续电泳 非连续电泳 胶浓度递增形成梯度 胶浓度均一没有梯度 分离胶 （浓度均一） 浓缩胶 （浓度均一） 电泳（槽）缓冲液：Tris-Gly缓冲液，pH8.3 配制浓缩胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液，pH6.7 梯度胶、非梯度胶、分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液，pH8.9 问题： 为什么Cl离子称为快离子或先导离子，而Gly离子称为慢离子？ 为什么样品在浓缩胶中被浓缩？ * Native electrophoresis (非变性电泳） Denaturation electrophoresis (变性电泳） Isoelectric focusing electrophoresis (等电聚焦电泳，IEE） Two dimensional (2D) electrophoresis (二维电泳） Variation of electrophoresis * 非变性电泳：电泳缓冲液、凝胶、上样缓冲液（溶解样品的缓冲液）中均不含蛋白质的变性因素，电泳过程中尽量维持蛋白质的构象不变。 变性电泳：在电泳缓冲液、凝胶中含有十二烷基磺酸钠(SDS)；上样缓冲液中含有SDS和二硫键还原剂 (如巯基乙醇，二硫苏糖醇[DTT]), 电泳前样品加热煮沸一般约5分钟。该电泳英文缩写：SDS* SDS的特点 （1） SDS能够与蛋白质结合，导致蛋白质变性。不同蛋白质-SDS复合物形状相似，都呈椭圆状； （2）大量SDS的负电荷使不同蛋白质本身所带电荷忽略不计，蛋白分子越大结合的SDS越多，各蛋白质-SDS复合物的电荷密度（ρ）趋于一致； （3）依据迁移速度, 则蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率取决于蛋白质（亚基）分子量的大小。 ? * SDS用来估测蛋白质的分子量 * Electrophoresis：检测分离纯化 效果 * IEF (等电聚焦电泳) separates proteins by pI The pH gradient in the gel is formed first by subjecting a mixture of small multicharged Polymers that have many pI values. * * 2D electrophoresis IEE + SDS* 2D electrophoresis * 1. 样品纯化的基本流程 2. 层析（Chromatography） 3. 电泳（Electrophoresis） 4. 肽的测序与合成 Sequencing Synthesis 5. ELISA与免疫印迹 6. 质谱（MS）与蛋白质研究 §2.5 蛋白质研究方法 * Sequencing Synthesis Insulin * Sanger经过10多年的努力，使用超过100g牛胰岛素（bovine insulin），于1953年公布测序结果。因该工作获得1958年的诺贝尔化学奖。 首个蛋白质的成功测序 1 IU(国际单位)＝45.5 μg 300 IU/支＝70元 * Steps for sequencing Step1: Analysis of AA composition Step2: Breaking disulfide bonds if existing Step3: ? Cleaving large peptide into small Step4: Sequencing of the small peptides Step5: Ordering the small peptides Step6: Locating disulfide bonds if existing * Step1: Analysis of AA composition Ala, 2Gly, Asp, Phe, Arg Peptide 6 N HCl; ~110°; ~ 24 h Ion-exchange chromatography * Step2: