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体外寡核苷酸介导的 DNA 突变技术 重叠延伸介导的定点诱变 6.2 基因敲除技术 6.2.1 6.2.2 基本原理 高等动物基因敲除技术 6.2.1 基本原理 经典遗传学 现代遗传学 基因敲除 (gene knock-out) 又称基因打靶 , 通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间的同源重组 , 进行精确的定点修饰和基 因改造 , 具有专一性强 , 染色体 DNA 可与目的片段共同稳 定遗传等特点 . 1. 完全基因敲除 打靶载体： 新霉素（ neomycin, Neo ）阳 性筛选标志 HSV-tk 阴性筛选标志：单纯疱 疹病毒 (herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase) 2. 条件型基因敲除 条件性基因剔除：对于重要功能基因进行 完全基因敲除会导致胚胎死亡，影响基因 功能研究。因此常用 Cre/LoxP 和 FLP/FRT 系 统进行组织特异性敲除。通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除 6.2.2 高等动物基因敲除技术 6.3 蛋白质及 RNA 相互作用技术 6.3.1 6.3.2 6.3.3 RNAi 酵母单杂交技术 酵母双杂交技术 技术及其应用 6.3.2 酵母双杂交技术 ? 用于分离与已知靶蛋白质相互作用基因的方法 一． 原理 ? 许多真核生物的转录激活因子都是由两个可 以分开的、功能上相互独立的结构域 (domain) 组成的。 酵母的转录激活因子 GAL4 ? BD (binding domain ) ? AD (activating domain) 6 分子生物学研究方法 ( 下 ) —— 基因功能研究技术 6.1 基因表达研究技术 6.1.1 6.1.2 RNA 6.1.3 6.1.4 基因表达系列分析技术 的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 一． ? 二． ? 6.1.1 基因表达系列分析技术 概念： 以 DNA 测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术 原理： 用锚定酶和标签酶两种限制性内切酶切割 DNA 分子的特 定位置 ( 靠近 3 端 ) ，分离出短核苷酸序列 (9 ～ lObp) 。 它包含了该转录本的足够信息。将一个体系的所有转 录本中这一短序列分离并连接到一个克隆载体中进行 测序．便可以得到该体系的所有转录本的表达情况。 二． 操作步骤 1. 以 biotin-oligo dT 为引物将 mRNA 反转录合成双链 cDNA ，以一种锚定酶（ Anchoring Enzyme, AE ） 进行酶切后，收集其 cDNA 的 3 ‘ 端部分。 2. 将收集的 3 端 cDNA 等分为两部分，分别同接头 A 、 B 相连接。每一种接头的结构都由 PCR 扩增引物 A 或 B 的序列、标签酶识别位点和锚定酶识别位点三部 分组成。 3. 连接产物以标签酶酶切后用 Klenow 酶补平 5 突出端，得到 两组分别带有接头 A 、 B 的短 cDNA 片段（约 50 个碱基）。混 合并连接两组短 cDNA 片段，形成一个约 100 个碱基的双标签 体（ ditag ）群，并以引物 A 和 B 对其进 PCR 扩增。 4. 用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除接头后的双标签体 （约 26 个碱基），并使之相互连接成为大片段的连接体， 克隆至质粒载体内形成一个 SAGE 文库以备集中测序。 5. 对测序得到的标签数据进行分析处理。 一． ? 6.1.2 RNA 的选择性剪接技术 概念 是指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合） 从一个 mRNA 前体产生不同的 mRNA 剪接异构体的过程。 二． 分类 三． 选择性剪接的研究方法（ RT-PCR ） 6.1.3 原位杂交技术 一． 概念 ? 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检 测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对 核酸进行定位和相对定量研究的一种手段 二． 分类 ? RNA 原位杂交技术 ? 染色体原位杂交技术 RNA 原位杂交技术 ? 原理：是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定 的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互 补原则退火（ annealling ）形成双链的过程。这一 杂交过程具有高度的特异性。 ? 待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是 未克隆化的基因组 DNA 核细胞 mRNA 。 ? 用于检测的已知核酸片段称之为探针（ probe ）。 常用