细胞培养试剂及操作流程.pdfVIP

实验规范化流程 一、细胞培养所需 1、10%FBS 1640培养液。 2、10%FBS DMEF/12 培养液。 3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。 4 、PBS：商品化的粉末，一袋溶于 2L 去离子水中，高压后 4℃保存。 5、胰酶 6、冻存液： 10%DMSO、10%FBS，其余成分为 1640 7、真核抗生素： G418: 50mg/ml MDA-MB-231 800ug/ml 药筛浓度 MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml T47D 400ug/ml) 嘌呤霉素（ Puromycin）:10mg/mL、 MCF-7 4ug/ml 药筛浓度 T47D 1ug/ml MDA-MB-231 5ug/ml 潮霉素（ Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/ml 药筛浓度 MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素） （使用浓度：1%原液） 环丙沙星 左氧氟沙星（储存浓度 5mg/ml ，使用浓度 5ug/ml ） 9、细胞因子： IL-6 、EGF （10ug/ml） 10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度 50Mm,使用浓度 0.01mM ） 一、细胞培养相关技术 1、细胞复苏 准备： 37℃水浴锅、培养液、 15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程： （1）将细胞从 -80℃或液氮取出，遵 ”慢冻速溶“的原则，迅速在 37℃下使其液 化。 （2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到 15ml 离心管内。 （3）将离心管以 1000rpm 转速离心 5min 。 （4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液 6ml ，重选吹匀后转 移到细胞培养瓶或培养皿，放入 37℃、5%CO2 细胞培养箱内培养。 2、细胞传代 准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、 15ml 离心管、滴管 实验流程： （1） 将覆盖率达 80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净， 必要时加 PBS 冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。 2 （2） 加入适量胰酶（一般 25cm 培养瓶加 0.5ml，10cmdish 加 1ml），并且晃 动几下使胰酶在平底分布均匀，放入 37℃培养箱孵育。 （3） 适当时间后（ 231、SK-BR3 用 1min ，MCF-7 、T47D 用 2min ，依据细胞 不同时间不同）将培养瓶从培养箱拿出来，显微镜下观察细胞形态变圆、 粘附性变弱后加入培养液终止酶反应。 （4） 用培养液冲洗瓶底，然后吹打细胞悬液使其均匀单个分布。 （5） 将悬液 1000r 离心 5min 后重悬，安装实际需要将悬液平分到培养瓶内， 一般按 1:3 传代较好。 3、细胞冻存 准备：培养液、胰酶、 15ml 离心管、滴管、冻存管、冻存盒 试验流程： （1） 将已经长满的细胞取出，弃去培养