生物化学：02蛋白质化学4.pptVIP

离心管先装好密度梯度介质溶液(常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖)，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低， * 改变pH或盐浓度，使目的蛋白与配体的结合力下降而被洗脱。 离子交换层析 凝胶过滤交换层析 亲和层析 三、蛋白质分子量的测定 1.凝胶过滤法 外 用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶过滤，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上课求出未知蛋白质对应的分子量。 2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS） 电泳:蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 聚丙烯酰胺凝胶 主要根据蛋白质电荷性质的不同进行分离 大小形状：小的、近球形的迁移速度快 SDS的作用 SDS存在下，蛋白质变性，肽链伸展，SDS与蛋白分子成比例结合→带负电荷复合物，消除不同蛋白间原有电荷差。 3. 超速离心 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 高速：25000rpm 超速：50000-120000rpm m’:微粒有效质量 ω:角速度 r:微粒界面与旋转中心的距离 ρ:离心介质密度 f:微粒摩擦系数 S:沉降系数,单位:S 沉降速度 质量、形状、密度 密度梯度离心 四、蛋白质的纯度鉴定 1. 电泳 等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF） 通过蛋白质等电点的差异而分 离蛋白质的电泳方法。在分离胶中加入具有一定pH梯度的两性电解质，每种蛋白质将移向并聚集在其等电点的pH梯度处。 双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis  蛋白质组学研究的重要技术 五、蛋白质含量的测定 紫外吸收法 280 nm吸收值 染料结合法 （Bradford法）考马斯亮蓝-G250： A595 / A465 ( 样品 ) ―A595 / A465 ( 对照 ) 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。 * 强酸、强碱使蛋白质变性，是因为强酸、强碱可以使蛋白质中的氢键断裂。也可以和游离的氨基或羧基形成盐 尿素、乙醇、丙酮等，它们可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。 临床医学上，变性因素常被应用来消毒 及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋 白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 * 蛋白质溶解度下降或易于沉淀。这是由于次级键破坏，肽链完全伸展，使整个蛋白质分子的空间构象变的松散、不稳定。同时，分子内部的疏水基团暴露而相互凝集成沉淀。 * 盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子间的作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。 * 水为高介电常数物质，有机溶剂相反，加入有机溶剂，降低水溶液介电常数。电学库仑定律，介电常数降低增加两相反电荷间的吸引力。 tritonX100是一种表面活性剂。具有疏水端和亲水端，它可以将膜蛋白从细胞膜上解离下来，从而达到提取膜蛋白的目的 * 盐析(salt precipitation)：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 * Porous：多孔的；pore：小孔 * 高速：25000rpm，89000g 超速：50000-120000rpm，70000g * Sediment：沉淀物 第五节蛋白质的理化性质 一、 蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜 二、蛋白质的两性性质和等电点 蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，