生物化学：03章酶化学3.pptVIP

四、 同工酶（isoenzyme or isozyme）  概念 同工酶是指由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂合体，催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 举例：乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase LDH） 催化的反应 乳酸 丙酮酸 LDH5 骨骼肌: 乳酸 丙酮酸 心肌: LDH1 H H H H H H H M H H M M H M M M M M M M LDH1 (H4) LDH2 (H3M) LDH3 (H2M2) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) 乳酸脱氢酶的同工酶 结构特征（2种亚基4聚体，5种同工酶） H：heart；M：muscle 电泳行为 乳酸脱氢酶同工酶在不同组织中的分布（%） 生理意义 心肌：LDH1（H4）对NAD Km值小，氧化供能 骨骼肌：LDH5 (M4) 对丙酮酸Km值小 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断 心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化 1 酶活性 心肌梗死酶谱 正常酶谱 肝病酶谱 2 3 4 5 *肌酸激酶（creatine phosphate kinase CPK） 催化的反应： 肌酸 + ATP = 肌酸磷酸 + ADP 结构：2种亚基2聚体，三种同工酶 MM , MB , BB 肌酸激酶同工酶在人体组织中的分布 肌酸激酶（CPK） 骨骼肌 心脏 脑 肝 胃 肾 总活力（IU/g） 1900-3000 380 160 4 125 18 MM 100 76 - 90 3 10 MB - 22 - 6 2 10 BB - 1 100 4 95 90 * * * 第七节酶的分离纯化和活力测定 一、酶分离纯化的一般原则 材料选择： 新鲜、酶含量丰富 所有蛋白质分离纯化的方法都适合酶 特别注意酶活性的保护，避免一切能引起蛋白变性的因素 每一步都要进行酶活力的测定，跟踪酶的去向，评价纯化方法。 二、酶活力与测定 1.酶活力 （enzyme activity） 一定条件下，酶催化某一化学反应的能力，以反应速度表示。酶活力与反应速度呈正比。 *反应速度：指单位时间内底物的减少量或产物的生成量。由于底物是过量的，减少量不易测准，所以通常以测定产物的生成量为准。 2.酶活力单位 （unit, U）  国际单位（IU, 1961 ）：一个国际单位指在最适条件下，每分钟催化1微摩尔 (μmol)底物减少或1微摩尔产物生成所需要的酶量（25?C）。 Katal（Kat ，1972 ）： 在最适条件下，每秒钟能催化1摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量定为1Kat。Kat与国际单位的换算如下：1Kat = 6x107IU 3. 酶的比活力 （specific activity，比活性） 每mg蛋白质所具有的酶活力 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml） 总活力＝单位体积酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml) 4. 转换数（TN or kcat) 单位时间内，每分子酶所能转换的底物分子数。 转换数 = V/ [Et] 在一定量的酶和过量底物的存在下，在酶最适反应条件下，（温度、pH、离子强度等），于反应的不同时间测定体系中产物生成量，计算反应速度。产物测定方法有：比色法、量气法、滴定法、分光光度法、荧光测定法、同位素测定法、酶偶联分析等。 5. 测定酶活力的一般方法 分光光度法（spectrophotometry） 要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。 简便、迅速、准确。 可检测到10-9mol/L水平的变化。 L-乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脱氢酶 酶偶联分析法(enzyme coupling assay)  第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。 葡萄糖 + ATP 葡糖-6-磷酸 + ADP 己糖激酶 葡糖-6-磷酸 + NADP 葡糖酸-6-磷酸 + NADPH + H+ G-6-P脱氢酶 三、回收率和纯化倍数 回收率 = 每次总活力 / 第一次总活力x 100% 纯化倍数 = 每次比活力 / 第一次比活力 * （5