2020蛋白质印迹法WesternBlot技术.pptVIP

Western blot 实验技术 2012.12.12 ? Western blot 的定义 ? Western blot 的基本原理 ? Western blot 的一般流程 ? Western blot 的常见问题 定义 印迹法（ blotting ）是指将样品转移到 固相载体上，而后利用相应的探测反 应来检测样品的一种方法。 Western blot 又成蛋白质印迹法，对单 项电泳后蛋白质分子的印迹分析称 western 印迹法，它是分子生物学、生 物化学和免疫遗传学中常用的一种实 验方法 , 且能对蛋白进行定性和半定量 的分析方法。 基本原理 Western blot 是通过特异性抗体对 凝胶电泳处理过的细胞或生物组织 样品进行着色。通过分析着色的位 置和着色的深度获得特定的蛋白质 在所分析的细胞或组织中的表达情 况的信息。 一般流程 ? 蛋白质样品的制备 ? SDS 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 ? 转膜 ? 封闭 ? 一抗杂交 ? 二抗杂交 ? 底物显色 蛋白质样品的制备 ? 从 -20 ℃冰箱取出细胞液，室温溶解后， 3000rpm 离心 5min ，吸去上清液，保留细 胞沉淀。每管加入一定量的上样缓冲液裂 解细胞，用手指轻弹以充分裂解细胞。充 分裂解后，煮沸 10min ，使蛋白变性， 12000rpm 离心 5min ，取上清，测蛋白含量， 用的是 TCA 蛋白测定法测蛋白含量。 （ 1 ） 25mg/mL BSA 的配制 : 取 0.8mL 蛋白标准配制液加入到一管蛋白 标 准 (20mg BSA) 中，充分溶解后配制 25mg/mL 的蛋白标准溶液。配制后可立即使用， 也以 - 20℃长期保存。 （ 2 ） 1mg/mL BSA 的配制 : 取 BSA 贮备液 25mg/mL （ 0.1mL ），用 1 × loading buffer （ 2.4mL ）稀释至 2.5mL ， 按 0.5mL 分装成 5 个包装，标记放入 - 20℃。 （ 3 ） 60% TCA 工作液的配制 : 取 2.2g TCA （三氯醋酸）溶于 3.67mL 双蒸水 中，即为 60% TCA 工作液，使用前配制。 （ 4 ）配制 BSA 标准系列和样品 如表格： BSA （ μg ） 1mg/mL BSA(μl) 1 × loading buffer （ μl ） ddH2O （ μl ） TCA （ μl ） 0 0 50 50 66.7 2.5 2.5 47.5 50 66.7 5 5 45 50 66.7 10 10 40 50 66.7 20 20 30 50 66.7 30 30 20 50 66.7 40 40 10 50 66.7 50 50 0 50 66.7 蛋白样品 5μl ， 1 × loading buffer 45μl ， ddH2O 50μl ， TCA 66.7μl ，放置 15-30min ， 用酶标仪， λ=595nm 处测定蛋白含量。 SDS电泳 基本原理： 在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS （十二烷基磺酸 钠）， SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质 的二级和三级结构，同时，在强还原剂（ beta- 巯基 乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS 溶液中，与 SDS 分子按比例结合 ( 多肽和 SDS 的质量比为 1:1.4) ， 形成带负电荷的 SDS- 蛋白质复合物，所带的负电荷大 大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同 分子之间原有的电荷差异 。 蛋白质 -SDS 复合物的形状近似于长的椭圆棒， 它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的 大小成比例。 因此，蛋白质 -SDS 复合物在 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影 响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质 亚基分子量的大小。 当蛋白质分子量在 15KD 到 200KD 之间时，电泳迁移 率与分子量的对数呈线性关系。 电泳步骤： 1. 清洗玻璃板 2. 灌胶与上样 （ 1 ）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂 直卡在架子上准备灌胶