1_血清免疫球蛋白IgG提取1.pptVIP

盐析法纯化血清中 IgG 类抗体 实验目的 掌握 盐析法 提取血清免疫球蛋白 IgG 抗体的原理 ? 熟悉血清 IgG 提取纯化操作过程和方法 ? 二、实验原理 ? 蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，它在一 定浓度的中性盐溶液中易于沉淀，而其他蛋白质组分在 此时不易沉淀，通过离心可将两者分离。 透析法脱盐 : 透析 是将含有小分子杂质 的蛋白质溶液装在半透膜 （玻璃纸、火绵纸等）制 的透析袋里放在透析缓冲 液中进行，可不断更换缓 冲液，直至杂质被除去 1mL 血清＋ 1mL 生理盐水 滴加饱和硫酸铵溶液 2mL 四 、 操 作 步 骤 室温静置 30min, 4 ℃ 离心， 4000rpm,10min 弃去上清液（含清蛋白） 沉淀溶于 1mL 生理盐水 , 滴加饱和硫酸铵溶液 0.5mL 室温静置 30min, 4 ℃ 离心， 4000rpm,10min 弃去上清液（ α 、 β 球蛋白） 沉淀溶于 1mL 生理盐水 , 滴加饱和硫酸铵溶液 0.5mL 室温静置 30min, 4 ℃ 离心， 4000rpm,10min 上清液（ β 球蛋白） 沉淀为 γ 球蛋白 沉淀溶于 1mL 生理盐水 移入透析袋，充分透析， 紫外分光光度计测定 蛋白 含量 五、结果判断 分别测 OD 280 和 OD 260 处的光密度值，按照公式计算 蛋白质浓度（ mg/ml ） = 1.45OD 280 — 0.74 OD 260 IgG 正常参考值 ： 8 ． 00 ～ 16 ． 00g ／ L 1. 效价可用免疫双扩散试验判断； 2. 3. 特异性则可通过双扩、免疫电泳或交叉凝集试验进行考察； 浓度也 可通过免疫浊度法等检测。 六、注意事项 ? 盐的饱和度： 影响盐析的重要因素，不同蛋白质的盐 析 要求盐的饱和度不同 ? pH 值 ： 在等电点时，蛋白质溶解度最小越易沉淀析出。 ? 蛋白质浓度 ： 越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限 愈低。过高也易引起其他杂蛋白共沉。 ? 温度 ： 一般可在室温下进行，某些对热特别敏感的酶， 则宜低温。 ? 脱盐 ： 透析时间较长，常在低温下进行，并加入防腐剂 避免变性或微生物的污染。 ? 饱和硫酸铵溶液的滴加方式： 逐滴，搅拌 ? 盐析后放置时间、离心操作的速度、时间 ? 透析袋的使用 七、方法学评价 ? 硫酸铵水中溶解度高，受温度影响小，不易使蛋白质 变性，操作简单，为盐析中常用的中性盐 ? 硫酸铵中含有氮，会干扰蛋白质的测定，且溶液的缓 冲能力差，故多用于大量蛋白的粗提。若要获得纯化 的免疫球蛋白，必须经过凝胶过滤、离子交换层析和 亲和层析进一步提纯