四种黑碳粒子诱导A549细胞的周期阻滞、凋亡与自噬效应的作用机理.pdfVIP

摘 要 目的：随着环境污染对人体健康影响研究日益深入，大气污染物中可入肺颗 粒物 （PM ）成为环境毒理学研究的热点。黑碳 （Black Carbon,BC）和重金属 2.5 （如Fe,Pb,Ni）是PM 的关键组分，由于BC 独特的理化性质 （如粒径小、比 2.5 表面积大和强烈的吸附性），黑碳在气-粒传输过程中，能极强的吸附有毒化学 物质 （如重金属和有机物），并在复杂的非均相光化学反应过程中形成二次黑碳 粒子，即黑碳-污染物复合体，进一步增加了PM 健康效应的复杂性和不确定性。 2.5 在本研究中，我们选用黑碳颗粒 （BC）和铅离子作为模型材料，通过探究4 种 黑碳粒子诱发A549细胞的自噬和溶酶体膜损伤，进而为黑碳-铅复合体产生细胞 毒性效应的作用机理提供理论依据。 方法：我们使用商品化黑碳粒子 （BC）, 并将黑碳氧化改性为羧化黑碳 （c-BC），羧化黑碳-铅复合体 （c-BC-Pb）和羧化黑碳和铅共暴露 （c-BC+Pb）， 并以未氧化改性的碳黑粒子和铅作为阳性对照。对4 种黑碳粒子的理化性质采用 元素分析（CEA）、透射电子显微镜（TEM）、电感耦合原子发射光谱（ICP-AES） 等进行了表征。 研究了4 种黑碳粒子分别暴露于A549细胞后诱发的毒性效应，包括细胞活 力的测定、氧化应激、炎症因子、细胞凋亡、细胞周期、自噬及溶酶体膜蛋白表 达等指标。其中细胞活力测定通过四唑盐比色法 （MTT）分别对4 种黑碳粒子 暴露A549细胞24h 后细胞存活率检测；采取活性氧簇（ROS）、乳酸脱氢酶（LDH） 试剂盒对比BC、c-BC、c-BC+Pb 和c-BC-Pb 四种黑碳粒子暴露后A549 细胞内 的氧化应激水平、细胞膜损伤的影响；采用酶联免疫法 （ELISA）检测25 μg/mL 剂量下四种黑碳粒子染毒暴露24h 后细胞炎症因子白介素6 （IL-6）、白介素8 （IL-8）以及肿瘤坏死因子 （TNF-α）的水平，同时通过RT-PCR 分析三种炎症 因子的mRNA 表达量；采用AnnexinVFITC/PI 荧光探针双染法标记四种黑碳粒 I 子暴露24h 的A549 并通过流式细胞仪 （FCM）检测早期晚期凋亡的发生，以及 PI 探针单染法进行细胞周期检测；采用蛋白质免疫印迹 （Western Blot）分别对 四种黑碳粒子染毒暴露16h 后的细胞蛋白进行电泳检测，选用一抗为自噬关键蛋 白LC3B 以及溶酶体膜关键蛋白lamp2，二抗为特异性山羊抗兔LgG，放射自显 影以检测电泳分离的自噬及溶酶体膜蛋白表达。 结果：通过现代分析技术表征了氧化改性的羧化黑碳 （c-BC）及羧化黑碳 铅 （c-BC-Pb）的理化性质。黑碳粒子诱发的A549细胞活力与LDH 水平变化趋 势一致，且呈现剂量依赖效应；氧化应激与抗氧化标志物水平的变化趋势也一致。 总之，黑碳粒子染毒后细胞活力下降，氧化活性氧 （ROS）的水平上升，细胞内 氧化还原失衡。此外，4 种黑碳粒子诱发细胞的炎症因子 （IL-6、IL-8、TNF-α） 水平明显的上升，尤其是c-BC-Pb和c-BC+Pb处理组的细胞炎症因子水平与c-BC 差异显著，提示铅在诱发炎症反应过程中起关键作用。细胞凋亡的研究结果表明： 四种黑碳粒子均能诱发明显的细胞凋亡，且呈现出剂量依赖效应，并且以 c-BC-Pb 组处理最为显著。细胞周期阻滞的研究结果表明：四种黒碳粒子对细胞 周期的阻滞效应均出现在S期，且呈剂量效应，c-BC+Pb 和c-BC-Pb 粒子阻滞尤 为显著，提示引入铅后对细胞周期阻滞有协同效应。采用蛋白质免疫印迹技术进 一步研究表明，四种黑碳粒子均可诱发细胞的自噬，而单独的铅离子不能诱导自 噬的发生。在高剂量下，c-BC-Pb 处理组能显著上调LC3-Ⅱ蛋白水平，而溶酶 体膜蛋白lamp2 的显著下调。质粒转染和透射电镜的结果进一步验证了自噬所依 赖的溶酶体膜结构受损。 结论：四种黑碳粒子均能诱发A549细胞的氧化应激、炎症反应、周期阻滞、 细胞凋亡和自噬等一系列的细胞毒性效应。尤其是黑碳-铅复合体 （c-BC-Pb）能 诱发更严重的氧化应激、细胞早期凋亡和S期阻滞的发生。此外，c-BC-Pb 能够 显著上调LC3-Ⅱ蛋白的表达和下