免疫印迹操作步骤.docx

1．主要内容 检测限为 2—20fmol，或约0. 1?Ing的50kDa蛋白质 有多个操作步骤，需 2 天 (或 1 天)时间完成。 检测抗原的存在，定量及其大小。 半定量至全定量。 抗原的检测依赖于耐变性的表位。 一般，低亲和力抗体亦可使用。 2.操作步骤 将蛋白质溶解于Laemmli样品缓冲液中。最终的样品缓冲液条件是 2% SDS、100mmol/ LDTT(从Imol /L的储存液中取出，临用前加入，该储存液置于 一20 C冷冻保存)、60mmol / LTris(pH6 . 8)、0。01 %溴 酚蓝和 10%甘油。全细胞可直接放在样品缓冲液中进行溶解；纯化或部分纯化的溶液可用 2%的样品缓冲 液1:1进行稀释。加热至70C 10min。最终蛋白质浓度应不超过 150ug/每孔(微型胶不超过15pg/每孔)。 将样品放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，移去平板，将凝胶剪成适当大小以进行转印。在凝胶 上作记号以确定方向。 剪 1 张硝酸纤维素膜和 4 张吸附滤纸 (Whatman 3MM 或替代物 )，其大小与凝胶相当。 将硝酸纤维素膜放入蒸馏水中润湿。将膜转入转印缓冲液中浸泡 5min。将吸水纸浸泡于转印缓冲液 中。转印缓冲液 1(20 000?400 000kDa 蛋白质)：48mmol/LTris，390mmol /L 甘氨酸、0. 1 %(w/v)SDS、 20%甲醇加蒸馏水至 1000ml。转印缓冲液2(80 000kDa蛋白质)：25mmol/LTris、190mol /L甘氨酸、20% 甲醇加蒸馏水至 1000ml 。 将凝胶、印迹膜、滤纸和支持垫浸入转印缓冲液中使其完全浸泡。小心地将支持垫中的气泡排出。 组装转印夹层组合：依次为支持垫、 2张吸水纸、凝胶、膜、 2张吸水纸和支持垫。将组装好的夹层 组合放入转印槽中，并使膜靠近正极 (阳极，红色电极 )。 于4C条件下转印过夜。分子质量 100 000kDa的蛋白质，先在28V转印1h,然后在84V转印14? 16ho分子质量100 000kDa的蛋白质，63V转印4?16h。 转印完成后，断开电源。卸下夹层组合装置，并在硝酸纤维素膜上作记号以保持原来的方向。 用PBS将膜清洗数次。 在室温下将膜放入 5%脱脂奶粉/ PBS中搅动孵育2ho然后从封闭液中取出印迹膜并用 PBS漂洗2 次，每次 5min o 加入一抗溶液。15cmXI5cm印迹膜用10ml。所有的溶液均用3 % BSA /PBS进行稀释。 在室温下将膜和抗体搅动孵育 1h。用PBS将膜漂洗4次，每次换液洗5rain。 加入辣根过氧化物酶标记的二抗试剂。 所有的溶液均用3% BSA / PBS进行稀释。对组织培养上清可 以不稀释或1 : 10稀释。这样获得的抗体浓度为 1Ps/ml和50ug/ml。如果是多克隆抗血清或腹水， 将10ul 稀释至10ml即可。如果抗体的浓度尚未知，需作若干稀释度以确定正确的浓度范围。 在室温下搅动孵育1ho用PBS将膜漂洗4次，每次换液洗5min。 (15 )在临用前，新鲜配制化学发光试剂。由于该试剂的半衰期非常短，故应按需配制。将膜放入此液内 孵育 lmin o 用纸巾吸去印迹膜边缘或边角部分过多的化学发光试剂。将印迹膜放入塑料袋中以确保干的表面与 胶片接触。 将印迹膜在暗室中使胶片曝光 lmin。冲洗胶片以确定待测抗原的正确曝光时间。曝光时间可短至几 秒钟，也可长达数小时。