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实验 3 培养基的配制及消毒灭菌 第一讲、培养基的配制 一、实验目的和内容 目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容： 1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。 2．高氏 1 号培养基的配制。 3．马丁氏培养基的配制。 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、 琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、孟加拉红、 链霉素、 1mol/L NaOH 、lmol/L HCl 、 KNO 3、 NaCl 、 K 2HPO4· 3H2O、 MgSO 4· 7H 2O、 FeSO4· 7H 2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、 pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。 三、操作步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl5g ，琼脂 15～ 20g，水 1000mL ， PH7.4～ 7.6 1．称药品 按实际用量计算后， 按配方称取各种药品放入大烧杯中。 牛肉膏可放在小 烧杯或表面皿中称量， 用热水溶解后倒入大烧杯；  也可放在称量纸上称量， 随后放入热水中， 牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2．加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用 玻棒搅拌， 待药品完全溶解后再补充水分至所需量。 若配制固体培养基， 则将称好的琼脂放 入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3． 调 pH 检测培养基的 pH ，若 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH ，边加边搅拌，并随 时用 pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱， 则用 lmol/L HCl 进行调节。 pH 的调节 通常放在加琼脂之前。应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4．过滤 液体培养基可用滤纸过滤， 固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤， 以利培养的 观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 5．分装 按实验要求， 可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。  分装时可用漏斗以 免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5 ，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过 其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 6．加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花 (非脱脂棉 )制作的棉塞。棉塞的形状、 大小和松紧度要合适， 四周紧贴管壁， 不留缝隙， 才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。 要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则 可用 8 层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7．包扎 加塞后， 将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸， 以防灭菌时冷凝水沾 湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起， 再于棉塞外包一层牛皮纸，用 绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。 8．灭菌 将上述培养基于 121.3℃湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则 应故人冰箱内暂存。 9．摆斜面 灭菌后， 如制斜面， 则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度， 便斜面的长度不超过试管总长的 1/2。 10．无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃温箱中培养 24～ 48h，无菌生长即可使用，或 贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。 （二）高氏 l 号培养基的配制 高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉 20g， KNO 3 1g， NaCl 0.5g，K 2HPO4·3H 2O 0.5g， MgSO 4· 7H 2O 0.5g ， FeSO · 7H O 0.01g ，琼脂 15～ 20g，水 1000mL ， pH7.4 ～ 7.6。 4 2 l．称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量 冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。 再加入其他成分依次溶解。对微量成分 FeSO4· 7H 2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入， 方法是先在 1000mL 中加入 1g 的 FeSO4·7H 2O，配成浓度为 0.01g/mL 的贮备液，再在 1000mL 培养基中加入以上贮备液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2． pH 调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （三）马丁氏培养基的配制 马丁氏培养基是用于