产纤维素酶菌种的筛选及优化.docxVIP

产纤维素酶菌种的筛选与优化 目记录 实验 1 分离和初筛实验 2 复筛和保存实验 3 酶活测定和继代保存实验 实验 4 紫外诱变育种实验 5 产纤维素酶菌株产酶条件优化实验 6 产酶条件优化结果 实验 1 了解产纤维素酶微生物分离的基本原理； 2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法 2，实验原理 自然界中有大量的纤维素物质，同时也有许多能分解纤维素物质 的生物，从 细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。这些生物和绿色植 物一起构成了世界的碳循环。 在发酵堆肥中， 有大量耐高温纤维素分 解菌，但大多数是混合分解菌。菌株需要 1。内切葡萄糖苷酶 (endo-1，4-β-d-葡聚糖酶，简称 EC 3.3.1.4，EBG)， 也称为 Cx 酶， CMC 酶，例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区，随机识别并水解 β-1， 4-糖苷键，截短长链纤维素分子，并产生大量末端不还原的纤 维素小分子。 2.胞外 -1，4-β-D-葡聚糖酶 (酶代码 3.2.1.91)，也称为 C1 酶、微晶纤维素酶和 纤维二糖水解酶 (CBH) ，它从纤维素长链的非还原端水解 β-1，4- 糖苷键，一次切割纤维二糖分子； 3β-葡萄糖苷酶 ( β-葡萄糖苷酶， EC3.2.21，缩写为 BG)，也称为纤 维二糖酶，可水解纤维二糖酶 糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖，并快速水解纤维二糖和纤维三 糖。随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低， 这种酶的特异性相对较差。只有三种酶协同作用， 才能很好地分解纤维素。就单个菌落而言，木霉、曲霉和青霉等 霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量， 因此用于畜牧业和饲料工业 的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。 在本实验中，以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。 使用羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 作为唯一碳源，并使用 CMC-Na 通过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。 刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色络合物。 3，实验仪器和试剂 1。土壤样本取自学校入口处 5-20 厘米深的小树林。 2。仪器试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、 电子秤、量筒、培养皿、酒精灯、移液管、接种环、高压灭菌锅等。 ； 3.培养基 (1)筛选培养基 (500 毫升 ) 羧甲基纤维素钠 10 克，(NH4)2SO4 1.4 克，硫酸镁 0.3 克 KH2PO4 2g 克，硫酸锰 1.6 毫克，硫酸亚铁 5 毫克硫酸锌 2.5 毫克，氯化钴 2.0 毫克琼脂 20 克 PH7.0 (2)保存培养基 (500 毫升 ) 羧甲基纤维素钠 15 克，硫酸镁 0.5 克， K2HPO4 1.5g 克，酵母粉 10 克氯化钠 5 克，蛋白胨 15 克，琼脂 20 克土壤样本是从学校入口 处 5-20 厘米深的小树林中采集的。 2.实验设备的消毒 :平板和吸管的包扎和消毒； 3。无菌水的制备 : 在 250 毫升锥形瓶中测量 99 毫升自来水，加入适量玻璃珠，用棉塞塞住，用牛皮纸包好， 并在 121？在 c 条件下灭菌 20 分钟备用将 9 毫升自来水倒入试管，用试管塞住，用牛皮纸包好，放在 121？在 c 条件下灭菌 20 分钟备用 4。筛选介质和倒置板的制备 : 根据筛选介质的配方，准确称取每种物质，溶于 1000 毫升蒸馏水 中，调节酸碱度至 pH7.0 在 121？c . 高温灭菌 20min，在无菌环境下 取出旧倒置板备用  5.保存介质的制备和倾斜  : 根据筛选介质的配方准确称量所有物质，将其溶于  1000  毫升蒸馏 水中，调节酸碱度至 pH7.0 分装试管放在 121？c . 高温灭菌 20min，取出摆动斜面备用 6.土壤样品预处理和梯度稀释 (1)样品细菌悬液 的制备首先取 1g 样品，加入 99 毫升含玻璃珠的无菌水中，摇匀 几分钟形成悬液 (2)梯度稀释 : 在无菌条件下，将 1 毫升无菌移液管放入装有 9 毫升无菌水的试 管中。 10 -3、10-4、 10-5 和 10-6 的梯度依次稀释，备用 7。倒置平板涂布 是通过将三种浓度分别为 10-4、10-5 和 10-6 的细菌悬浮液接种到倾倒的平板中来进行的。均匀分布。培养、观察并记录 实验 2 产纤维素酶菌株筛选及保藏 1，实验目的 1。掌握平板连接斜面的操作； 2.掌握筛选原则和选择方法 2，实验原理 刚果红可与纤维素结合，纤维素酶可水解纤维素，使刚果红可与 纤维素结合，在产纤维素菌株 周围形成透明圈，从而选择目标菌落。 微生物的繁殖具有易变异的特点。同时，微生物的生长通常不能 与生长所需的营养、 水分、氧气和环境温度分开。 在