牙龈卟啉单胞菌通过激活YAP_TAZ诱导miR--21--5p_PTEN_自噬促进食管鳞癌演进.pdf

摘要 摘 要 目的：探讨食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC ）中牙龈卟 啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis ）富集与自噬相关分子的相关 性和自噬相关分子变化的临床意义，确定P. gingivalis 通过YAP/TAZ 调控miR- 21-5p/PTEN 促进自噬及 ESCC 的恶性演进，从自噬角度阐明P. gingivalis 促进 ESCC 发展的分子机制，鉴定 P. gingivalis 诱导的自噬关键分子，为开发 ESCC 分子治疗靶点提供理论基础。 方法： 1 采用免疫组化方法检测 LC3 、p62 在 82 对 ESCC 及相应癌旁组织中的表 达，并分析其表达与 ESCC 组织中P. gingivalis 丰度、ESCC 患者临床病理特征 及生存期的相关性。 2 采用Western blot 方法检测P. gingivalis 感染ESCC 细胞后LC3 Ⅱ、p62 、 ULK1 、Atg7 、Atg14 、Beclin 1 、PI3K Ⅲ、PTEN 等分子蛋白水平变化。 3 采用 q-PCR 方法检测自噬通路相关基因 miR-21-5p 、Atg7 、ULK1 在 ESCC 及相应癌旁组织、感染P. gingivalis 前后的ESCC 细胞中mRNA 水平的表 达，并分析其表达与P. gingivalis 丰度的相关性。 4 mRFP-GFP-LC3 标记 ESCC 细胞 KYSE70 、KYSE140 ，共聚焦显微镜检测 ESCC 细胞感染 P. gingivalis 前后、干预自噬或相关分子后自噬囊泡的形成与改 变。 5 ESCC 细胞中以 siRNA 介导沉默YAP/TAZ 、miR-21-5p 及Atg7 等基因表 达，或过表达 YAP/TAZ ，Western blot 、q-PCR 、迁移、侵袭等方法检测其对 P. gingivalis 所诱导的 ESCC 细胞自噬活性、迁移及侵袭能力的影响，明确 YAP/TAZ 与miR-21-5p 之间的调控关系。 6 建立裸鼠皮下 ESCC 模型，氯喹及miR-2 1-5p、Atg7 和YAP/TAZ 抑制剂 治疗各组实验鼠，抑制ESCC 细胞自噬，检测这些干预方式对P. gingivalis 促癌 功能的阻断作用。 7 统计分析：统计学分析均采用 SPSS19.0 统计学软件分析，Western blot 与q-PCR 结果的定量差异分析采用配对t 检验，LC3 、p62 蛋白表达与ESCC 临 床病理特征相关性分析及免疫组化结果分析采用卡方检验，动物实验采用随机分 组方法（非参检验），用 Kaplan-Meier 绘制生存曲线，检验生存时间之间的差 异选用Log-rank ，检验水准为P 0.05 。 结果： I 摘要 1 免疫组化结果表明，ESCC 中 LC3 高表达率明显高于其相应的癌旁组 织，并且其高表达与P. gingivalis 丰度、ESCC 浸润深度、ESCC 患者预后不良呈 正相关；ESCC 中p62 表达低于其相应的癌旁组织，p62 低表达与 ESCC 组织中 P. gingivalis 丰度、ESCC 淋巴结转移、TNM 分期、ESCC 患者预后不良呈正相 关。 2 P. gingivalis 感染 ESC