蛋白质与dna的相互作用.pptVIP

蛋白质与 DNA 的相互作用 ? 分类： 与单链 RNA 结合 与茎环结构结合 与双链 DNA 结合：普遍性结合 特异性结合 ? 蛋白质与 DNA 结合的特性： 1.DNA 识别部位有二度对称性。蛋白质一般是 有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋 转对称性，与硷基的旋转对称吻合。 2. 蛋白质和 DNA 的接触区只在 DNA 的一侧。 3. 在结合过程中，蛋白质和 DNA 都有构像改变。 4. 普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与 DNA 骨架的磷酸基团形成离子键。 5. 特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与 DNA 特 定硷基接触。 ? 蛋白质与 DNA 的普遍性结合中 DNA 特点： 蛋白质与 DNA 主链骨架接触，大多数涉 及磷酸二酯键中的氧原子。 与 DNA 硷基序列特异性无关 结构的匹配性： 旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力 1. 蛋白质和 DNA 都存在 0.7nm 的重复距离 DNA 双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是 0.7nm 。 β—折叠， N 原子间距离是 0.7nm 伸展β—折叠 C β 间距离是 0.7nm α—螺旋， Arg 和 Lys 被另外三个残基隔开，带正 电荷侧链的距离是 0.7nm. 2.DNA 对称性 平移对称： GCATCT GCATCT CGTAGA CGTAGA 二重轴对称 GCATCT TCTACG CGTAGA AGATGC 二重旋转对称 GCATCT AGATGC CGTAGA TCTACG 旋转对称 GCATCT CGTACA CGTAGA GCATGT ? 蛋白质与 DNA 特异性结合中 DNA 特点： 大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键 N N O H N N N H N N O N H C O O C C N H H N H H H Glu Agr H ? 蛋白质与 DNA 普遍结合中蛋白质特点： β - 折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合 可能是通过识别小沟结构实现 1. 富含脯氨酸和碱性氨基酸 组蛋白有重复的 SPKK Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg PRGRP 序列与 A-T 碱基对结合 KPRGRPK 序列也能与小沟 A-T 结合 2. 碱性螺旋 组蛋白 H1C 端 57 个氨基酸 Lys 和 Gly,Lys 在螺旋两侧， Gly 夹在中间 3. 蛋白磷酸化作用 SP X X ： Ser 磷酸化 TPKK ： Tyr 磷酸化 磷酸化后和 DNA 结合能力下降 磷酸化失去氢键 ? 蛋白质与 DNA 特异性结合中蛋白质特点： 1. 蛋白质多形成二聚体 ? HTH 复合物 ? 亮氨酸拉链结构 NH 2 COOH 碱性氨基酸 Agr 和 Lys 锌指结构 ? Agr 和 G 形成氢键 ? 细胞核蛋白质的提取 收集细胞，洗去血清和培养基 裂解细胞： Triton X-100 NP-40 去胞浆成分 裂解细胞核：高浓度 KCl :600mM 变更缓冲液浓度 ? 快速抽提 裂解液： 提取液： 10mM HRPES 250mM Tris 1mM EDTA 60mM KCl 60mM KCl 1mM DTT 1mM DTT 1mM PMSF 1mM PMSF pH 7.9 0.5% NP-40 pH 7.9 1X10 7 细胞 100ul 裂解液、冰浴 5 分钟、离心 沉淀 用不含 NP-40 的裂解液洗一次 100ul 提取缓冲液 干冰异丙醇速冻，反复冻融 3 次 离心 沉淀 — 80 0 C 保存 凝胶滞后试验 1. 蛋白质和 DNA 结合复合物半衰期短 电泳缓冲液低离子强度 凝胶的笼效应 2. 探针以 20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合， 过大增加非特异性结合。 3. 用竞争性抑制检测 DNA 与蛋白质结合的特异 性 4. 加 3ug Poly(dI-dC) 减少非特异性结合 5. 超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用 6. 只能确定结合，无法确定序列 DNA 足迹分析 DNA 足迹分析 1.DNAase Ⅰ随机水解核苷酸磷酸二酯键 每一个 DNA 分子最好只切一次 2. 蛋白质与 DNA 结合保护 DNA 不被切割 3. 电泳用的是变性凝胶： 相差一个核苷酸 DNA 彼此分开 蛋白质从 DNA 分子上脱落 4. 可确定与蛋白质结合的 DNA 序列 5.DNA 序列是固定的