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蛋白质组学实验 考 试 安 排 ? 科 学 素 质： 10% ? 实 验 操 作： 10% ? 实验结果与报告： 40% ? 实验原理测验： 40% 科 学 素 质 ? 课堂提问 ? 原始实验记录 ? 团队合作 ? 课堂纪律 ? 仪器、用具的使用 ? 台面整洁 ? 考勤 ? 卫生值日 实 验 操 作 1 、平时表现 2 、以其中两次实验的操作为主要评分依据。 实验结果与报告 根据个人所有实验的结果与实验报告的 评分，取平均分。 实验原理测验 ? 考试时间：第 8 周 ? 考试地点：本实验室 ? 考试形式：笔试 ? 考试内容： 实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注意事 项，理论知识，操作要点等。 实 验 一 目的基因的原核表达、纯化 及鉴定 实验目的 ? 掌握目的基因原核 诱导表达 的原理及方法 ? 了解目的蛋白质 “标签”纯化 的基本原理和 方法 ? 掌握 PAGE 变性凝胶电泳的原理及方法 ? 掌握考马斯亮蓝染色的方法 ? 目的蛋白质的诱导表达 ? 目的蛋白质的纯化 ? 目的蛋白质的检测 实验原理 转化表达宿主菌 诱导优化表达目的蛋白 纯化目的蛋白 1. 转化带有 T7RNA 聚合酶基因 的菌株 1. 确定表达时间和温度的最佳条件 2. 分析蛋白溶解性 3. SDS, Western 印迹等 确定目的蛋白 1. 放大培养 2. 制备粗提物 3. 亲和纯化 （一） 目的蛋白的原核诱导表达 实 验 目 的 1. 掌握蛋白质诱导表达的原理 2. 学习蛋白质诱导表达的方法 3. 了解重组蛋白质表达的体系及其优缺点 背景理论知识 Section 1 ? 蛋白质的表达是指为获取大量的目标蛋白而进行 的有目的性的蛋白质合成。 ? 需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其他载体， 然后导入活细胞，外源基因可在宿主细胞高效表 达，从而获得有重要价值的蛋白质产品。 ? 包括外源基因的克隆、转录、翻译、加工、分离 纯化。 ? 进行大量表达和纯化是为了在体外进行功能分析。 大 肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物 学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首 选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用 低，生产成本低廉。 原核表达的特点 ? 细菌 RNA 聚合酶不能识别真核基因启动子 ? 真核基因 mRNA 无 SD 序列，不能启动翻译 ? 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子 , 要求 cDNA ? 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏 ? 缺乏翻译后加工体系 ? 不溶性的包涵体 在 E.Coli 中表达重组蛋白： ? 目的基因受噬菌体 T7 强转录及翻译信号控制 ? 表达由宿主细胞提供的 T7 RNA 聚合酶诱导 ? 充分诱导 : 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白 , 数小时后达细胞总蛋白的 50% 以上 ? 非诱导条件下 : 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录 实验原理 目的蛋白质的诱导表达 lacI （ Lactose ） lacI 是大肠杆菌中 lac 操纵子 （ Operon ）的调节基因，它 所表达的阻遏蛋白是 lac 操纵 基因（ Operator ）的抑制因子， 抑制转录启动。 当有乳糖存在时，这种阻遏蛋 白能与过量的乳糖结合而失去 对操纵基因的抑制，使 lac 操 纵子上的结构基因 lacZ （ β - 半 乳糖苷酶 ) 、 lacY （透性酶 ) 、 lacA ( 乙酰基转移酶）得以正 常表达，启动转录。 IPTG （异丙基 - β -D-1- 硫代半 乳糖苷 ) 作为乳糖的类似物与 lacI 阻遏蛋白结合而使操纵基 因不被抑制，因此 IPTG 经常 作为 lac 操纵子的诱导剂而使 用。 实验原理 E. Coli BL21 （ DE3 ）： DE3 是整合在细菌基因组上的一 种携带 T7 RNA 聚合酶基因和 lacI 基因的λ噬菌体，其 基因型为： lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5 lacI 产生的阻遏蛋白与 lac 操纵基因结合，从而不能 进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。 IPTG 为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结 合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源 基因大量转录并高效表达。 ? 原核表达系统菌株 ? 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳 定，所以一些 蛋白酶缺陷型菌株 往往成为理想的起始表达 菌株。 ? 经典的 E. coli BL21 系列就是 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型。 ? 大名鼎鼎的 BL21(DE3) 则是添加 T7 聚合酶基因，为 T7 表达 系统而设计。 ? 原核表达质粒的构建 ? 目的基因 ? 表达载体 Plasmid Tag lacI q Promoter Amp r