鸡MDA5互作蛋白的筛选和过表达鸡MDA5的DF1细胞转录组测序分析.pdfVIP

鸡MDA5 互作蛋白的筛选和过表达鸡MDA5 的DF1 细胞转录组测序分析 目录 摘 要 i Abstract iii 缩略语表(Abbreviation) v 1 文献综述 1 1.1 天然免疫 1 1.2 模式识别受体 1 1.3 HNRNP 家族蛋白 6 1.4 蛋白互作组学及主要研究方法 7 1.5 GST-pull down 技术简介 7 1.6 转录组学研究 8 1.7 转录组测序技术 9 1.8 二代测序 9 1.9 转录组测序技术在家禽上的应用 9 1.10 GO 和KEGG 分析 10 2 研究目的和意义 11 3 材料与方法 12 3.1 材料 12 3.1.1 载体和菌株 12 3.1.2 siRNA 合成 13 3.1.3 细胞和病毒 13 3.1.4 常用试剂 13 3.1.5 抗体 14 3.1.6 常用试剂的配制 14 3.2 方法 16 3.2.1 细胞的冻存、复苏和传代 16 3.2.2 基因克隆和表达载体构建 16 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位论文 3.2.3 转染19 3.2.4 病毒蚀斑实验20 3.2.5 病毒感染20 3.2.6 Trizol 法提取RNA 20 3.2.7 反转录PCR 21 3.2.8 实时荧光定量PCR 21 3.2.9 蛋白样收集预处理22 3.2.10 Western Blot 23 3.2.11 双荧光素酶报告实验25 3.2.12 间接免疫荧光25 3.2.13 银染25 3.2.14 转录组测序27 3.2.15 统计学处理27 4 结果分析28 4.1 鸡MDA5 互作蛋白的鉴定及其调节干扰素产生的机制研究28 4.1.1 构建鸡IFN-β-luc 报告系统28 4.1.2 鸡MDA5-N 及与其互作蛋白的纯化29 4.1.3 质谱鉴定鸡MDA5 互作蛋白29 4.1.4 鸡MDA5 互作蛋白的互作网络构建及功能注释30 4.1.5 互作蛋白的克隆及真核表达33 4.1.6 双荧光报告系统筛选对鸡MDA5 诱导鸡IFN-β 启动子活性有影响的蛋白33 4.1.7 互作蛋白对鸡IFN-β 表达的影响35 4.1.8 宿主蛋白与鸡MDA5 的互作验证36 4.1.9 鸡hnRNPH2 靶向鸡MDA5-N 抑制鸡IFN-β 表达38 4.1.10 鸡hnRNPH2 能减弱鸡MDA5 与鸡MAVS 的相互作用40 4.1.11 鸡hnRNPH2 促进流感病毒H5N6 在DF1 细胞上增殖41 4.1.12 结果与讨论43 4.2 过表达鸡MDA5 和poly(I:C)刺激后DF1 细胞转录组测序分析45 4.2.1 过表达鸡MDA5 和 poly(I:C)刺激激活DF1 细胞中鸡IFN-β 表达45 4.2.2 数据评估及质控46 II 4.2.3 不同处理后DF1 细胞差异表达基因分析 47 4.2.4 差异表达基因功能注释 48 4.2.5 差异表达基因PPI 网络构建和分析 51 4.2.6 差异表达基因的qRT-PCR 验证 53 4.2.7 鸡MX1 、IFI6 、IFIT5 、RSAD2 和OASL 抑制H5N6 病毒感染DF1 细胞 54 4.2.8 结果与讨论 55 5 结论 58 参考文献 59 附录 68 致谢 73 III 鸡MDA5 互作蛋白的筛选和过表达鸡MDA5 的DF1 细胞转录组测序分析 摘 要 作为机体抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线，天然免疫在保护机体健康方 面发挥了重要作用。其主要通过模式识别受体(Pattern