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CXCL12、VEGFA 和 WNT5A 优化猪卵母细胞体外成熟体系及机制研究 目录 摘要i Abstract iii 缩略词表v 1 前言 1 1.1 问题的由来 1 1.2 卵母细胞成熟过程 1 1.2.1 卵母细胞核成熟2 1.2.2 卵母细胞质成熟3 1.2.3 颗粒细胞扩展4 1.3 影响卵母细胞体外成熟的因素5 1.3.1 动物本身的状况5 1.3.2 卵巢采集月份6 1.3.3 卵母细胞获得方式6 1.3.4 温度和渗透压7 1.3.5 卵丘卵母细胞复合体的质量7 1.4 卵母细胞体外成熟培养液开发及优化8 1.4.1 常用IVM 培养液8 1.4.2 添加猪卵泡液 10 1.4.3 添加激素 10 1.4.4 添加细胞因子和生长因子 11 1.5 血管内皮生长因子 11 1.5.1 VEGF 在生殖系统中的研究 12 1.6 基质衍生因子 13 1.6.1 CXCL12 在生殖系统中的研究 13 1.7 WNT5A 13 1.7.1 WNT5A 在生殖系统中的研究 14 1.8 丝裂原活化蛋白激酶信号通路 14 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位（毕业）论文 1.9 WNT 信号通路 16 1.10 早期胚胎发育历程 17 1.10.1 IVM 卵母细胞决定早期胚胎发育能力 18 1.11 研究目的 18 2 材料与方法20 2.1 试验材料20 2.1.2 抗体20 2.1.3 主要试剂20 2.1.4 主要试剂配制21 2.1.4 主要仪器29 2.2 试验方法30 2.2.1 猪卵母细胞体外收集与培养30 2.2.2 孤雌激活以及早期胚胎体外培养31 2.2.3 体外受精和早期胚胎体外培养31 2.2.4 纺锤体染色33 2.2.5 皮质颗粒分布34 2.2.6 早期卵母细胞凋亡检测34 2.2.7 卵母细胞TZPs 分析34 2.2.8 免疫荧光染色35 2.2.9 囊胚凋亡检测35 2.2.10 卵丘扩展鉴定35 2.2.11 试剂盒提取RNA 36 2.2.12 反转录36 2.2.13 实时荧光定量PCR 37 2.2.14 蛋白免疫印迹38 2.2.15 统计分析39 3 结果与分析40 3.1 利用猪生殖道转录组分析确定细胞因子40 3.2 确定CVW 对IVM 卵母细胞影响的最适浓度43 II CXCL12、VEGFA 和 WNT5A 优化猪卵母细胞体外成熟体系及机制研究 3.3 CVW 促进IVM 卵母细胞PB1 排出45 3.4 CVW 提高IVM 卵母细胞质量47 3.5 CVW 促进IVM 卵丘扩展50 3.6 CVW 降低IVM 卵母细胞多精受精52 3.7 CVW 提前激活IVM 中MAPK 通路并调节WNT 信号通路54 3.8 CVW 促进IVM 卵母细胞发育能力57 3.9 CVW 提高IVM 卵母细胞随后发育质量61 4 讨论66 4.1 选择CVW 的可行性66 4.2 CVW 对猪IVM 的优化作用66 4.3 CVW 对猪IVM 的优化机制68 4.4 CVW 提高卵母细胞的发育潜力69 5 结论71 5.1 本研究的主要结论71 5.2 论文的创新与不足之处以及下一步计划71 参考文献72 致谢83 III CXCL12、VEGFA 和 WNT5A 优化猪卵母细胞体外成熟体系及机制研究 摘要 基因编辑技术和动物克隆技术的结合使基因操作在猪的分子育种和动物模 型构建上变得简易高效，但该技术体系需要大量的卵母细胞来生产克隆胚胎。目 前在大动物上主要是从屠宰场获得废弃卵巢组织，再从中获取未成熟的卵母细胞 进行体外成熟，