萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究.pdfVIP

萝卜蚜端粒逆转录酶TERT 基因克隆及功能探究 目 录 摘 要 i Abstract iii 1. 前言 1 1.1 萝卜蚜概述 1 1.1.1 萝卜蚜形态特征 1 1.1.2 萝卜蚜生活习性 2 1.1.3 萝卜蚜危害 2 1.1.4 萝卜蚜综合防治 3 1.2 端粒和端粒逆转录酶 5 1.2.1 端粒结构与概念 6 1.2.2 端粒功能 7 1.2.3 端粒酶结构与概念 7 1.2.4 端粒酶功能 8 1.2.5 端粒逆转录酶TERT 基因功能研究 9 1.2.6 端粒及端粒酶在昆虫中的研究 11 1.3 RNA 干扰（RNA inference ）简介 12 1.3.1 RNAi 发现历史 12 1.3.2 RNAi 的作用机制 12 1.4 RNA 干扰的常用方法 13 1.4.1 显微注射法 14 1.4.2 浸泡法 14 1.4.3 饲喂法 14 1.5 RNAi 技术在昆虫学研究中的研究进展 15 1.5.1 昆虫中基因功能的研究 16 1.5.2 害虫防治 17 1.6 本研究的目的意义及创新点 18 1.6.1 本研究的目的意义 18 1.6.2 本研究创新点 18 1.7 研究内容与技术路线 18 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位（毕业）论文 1.7.1 研究内容18 1.7.2 技术路线19 2. 材料与方法20 2.1 实验材料20 2.1.1 供试昆虫20 2.1.2 供试仪器20 2.1.3 供试试剂及缓冲液配制21 2.1.4 供试引物序列22 2.2 萝卜蚜TERT 基因克隆及生物信息学分析22 2.2.1 基因检测样品收集22 2.2.2 萝卜蚜总RNA 提取（Trizol 法）23 2.2.3 cDNA 合成23 2.2.4 端粒逆转录酶TERT 基因CDS 序列克隆24 2.2.5 端粒逆转录酶TERT 基因生物信息学分析24 2.3 萝卜蚜TERT 基因时间及时空表达25 2.3.1 基因检测样品收集25 2.3.2 萝卜蚜总RNA 提取（Trizol 法）25 2.3.3 cDNA 合成25 2.3.4 实时荧光定量PCR 分析TERT 表达量25 2.4 萝卜蚜端粒逆转录酶TERT 基因RNAi 研究26 2.4.1 dsRNA 表达载体的构建26 2.4.2 dsRNA 表达检测31 2.4.3 dsRNA 表达纯化31 2.4.4 dsRNA 降解情况检测32 2.4.5 萝卜蚜dsRNA 饲喂和生物测定32 2.4.6 利用qRT-PCR 检测RNA 干扰效率33 2.5 转端粒逆转录酶TERT 基因拟南芥构建33 2.5.1 转基因表达载体构建33 2.5.2 转基因表达载体检测34 2.5.3 转基因拟南芥的构建35 II 萝卜蚜端粒逆转录酶TERT 基因克隆及功能探究 2.5.4 阳性植株筛选及PCR 检测 35 2.6 RNA 干扰后萝卜蚜转录组分析 36