猪胞内劳森菌分离培养及基于PK-PD的替米考星给药方案制定.pdfVIP

猪胞内劳森菌分离培养及基于PK-PD 的替米考星给药方案制定 目录 摘 要i ABSTRACTiiv 缩略语表viii 1前言1 1.1立题依据1 1.2 国内外研究进展3 1.2.1 胞内劳森菌研究进展3 1.2.2 抗菌药物在猪增生性回肠炎治疗中的研究进展4 1.2.3 药动学-药效学模型研究进展6 1.3 研究内容与目标9 1.3.1 研究内容9 1.3.2 研究目标10 2 材料与方法 11 2.1 药品与试剂 11 2.1.1 药品 11 2.1.2 试剂 11 2.1.3 药物溶液和培养基的配制13 2.2 主要仪器与设备13 2.3 菌种、细胞与动物14 2.3.1 菌种14 2.3.2 细胞15 2.3.3 动物15 2.4 胞内劳森菌鉴定体系的建立15 2.4.1PCR 鉴定体系的建立15 2.4.2 实时荧光定量PCR 鉴定体系的建立17 2.4.3过氧化物酶细胞单层染色法鉴定体系的建立20 2.5 胞内劳森菌分离体系的优化21 2.5.1剂量的优化21 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位 （毕业）论文 2.5.2 孵育时间的优化21 2.5.3滤膜孔径的优化21 2.6 猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞中培养方法的优化21 2.7 胞内劳森菌临床菌株的分离22 2.8 替米考星对猪胞内劳森菌的抗菌作用研究22 2.8.1 猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞中生长曲线的测定22 2.8.2MTT 法检测替米考星对猪空肠上皮细胞活力的影响22 2.8.3 替米考星对猪胞内劳森菌胞外和胞内MIC 的测定23 2.8.4 替米考星对猪胞内劳森菌体外和半体内胞内杀菌曲线的绘制24 2.8.5 替米考星对猪胞内劳森菌MPC 的测定24 2.8.6 替米考星对猪胞内劳森菌PAE 的测定25 2.9 替米考星预混剂和混悬剂在猪体内的药动学研究25 2.9.1 替米考星在猪血浆和回肠内容物中高效液相色谱方法的建立25 2.9.2 仔猪回肠瘘管安置手术27 2.9.3 人工感染仔猪增生性肠炎模型的建立27 2.9.4 猪血浆和回肠内容物样品的采集27 2.9.5 药动学模型拟合27 2.9.6 替米考星在回肠内容物中蛋白结合率的测定28 2.10PK-PD 模型的构建28 2.10.1 半体内PK-PD 模型拟合28 2.10.2 给药剂量计算29 3 结果与分析30 3.1胞内劳森菌鉴定体系的建立30 3.1.1PCR 鉴定体系30 3.1.2 实时荧光定量PCR 鉴定体系30 3.1.3过氧化物酶细胞单层染色法鉴定体系32 3.2 胞内劳森菌的分离体系33 3.3 分离菌株的鉴定34 3.4 培养方法的优化34 3.5 替米考星对胞内劳森菌的抗菌作用35 II 猪胞内劳森菌分离培养及基于PK-PD 的替米考星给药方案制定 3.5.1 生长曲线30 3.5.2 替米考星的细胞毒性36 3.5.3 替米考星对胞内劳森菌胞内和胞外MIC37 3.5.4 体外和半体内胞内杀菌曲线37 3.5.5 替米考星对胞内劳森菌的MPC41 3.5.6 替米考星对胞内劳森菌的PAE41 3.6 替米考星预混剂和混悬剂在猪体内的药动学特征42 3.6.1 替米考星的高效液相色谱检测方法42 3.6.2 血浆中的药动学特征45 3.6.3 回肠内容物中的药动学特征48 3.6.4 蛋白结合率50 3.7PK-PD 拟合50 3.7.1 药效学目标50 3.7.2 给药方案的制定55 4 讨论59 4.1 猪胞内劳森菌的鉴定59 4.2 猪胞内劳森菌的分离60 4.3 猪胞内劳森菌的培养61 4.4 猪胞内劳森菌的药效学研究62 4.5 替米考星预混剂和混悬剂在猪血浆和回肠中的药动学研究64 4.6 SigmiodEmax 模型的拟合和给药剂量的确定65 5 全文总结67 6 文献综述68 6.1 胞内劳森菌的检测68