蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法.docx

《生物化学实验技术》课程作业 蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法 [实验目的 ] 学习、掌握考马斯亮蓝法（ Bradford 法）测定蛋白质含量的方法 [实验原理 ] 考马斯亮蓝 G 250染料 碱性 磷酸 变为 595nm（蓝色） 氨基酸 max 芳香族 [器材与试剂 ] 器材 722 型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管 16 支 试剂 1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（ BSA ），配制成 1.00mg/ml 。 2.考马斯亮蓝 G-250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮蓝，溶于 50ml 95% 的乙醇后，再加入 120ml 85% 的磷酸，用水稀释至 1 升。 [实验方法 ] 标准方法 1.取 10 支试管， 分别编号后按 表 1 剂量依次加入标准蛋白 （或未知蛋白） 、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料 20min 后，使用 722 分光光度计，塑料比色皿，在 595nm 处测量吸光度 A 595。 3.用标准蛋白浓度（ mg/ml ）为横坐标，用 A 595 为纵坐标，进行直线拟合，得到标准 曲线。根据测得的未知样品的 A595 ，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根 据所测样品的吸光度 ,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量 ,按下式计算 : 样品蛋白质含量 (μ g/g 鲜重 ) = 查得的蛋白质（ g / g） 提取液总体积（ ml ） 样品重（ g） 测定时提取液体积（ ml ） SDS 干扰实验 1.取 5 支试管， 分别编号后按表 2 剂量依次加入标准蛋白、 SDS、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料 20min 后，使用 753 分光光度计，塑料比色皿，在 595nm 处测量吸光度 A 595。 [实验数据与结果分析 ] （一）标准方法的数据和图 表 1 考马斯亮蓝标准法实验表格 第 1页 《生物化学实验技术》课程作业 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 （ 1.00mg/ml ） 未知蛋白质 0.04 0.08 0.10 （约 0.5mg/ml ） 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 0.02 0 考马斯亮蓝 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 G-250 试剂 对应的吸光度 A 595 根据表 1，以 A595 为纵坐标，标准蛋白质量 /（μ g）为横坐标，作图 1。 图1 考马斯亮兰标准法 ( 参考 ) 1 0.8 5 0.6 9 5 y = 6.1884 x + 0.2287 A 0.4 2 R = 0.9942 0.2 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 标准蛋白质量 / （μ g） 图 1 考马斯亮蓝标准法 根据线性拟合公式 y=ax+b 计算所测溶液的蛋白质的含量。 （二） SDS 干扰数据和图 表 2 考马斯亮蓝 SDS 干扰实验表格 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 （ 1.00mg/ml ） SDS (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 蒸馏水 0.9 0.8 0.7 0.5 0.3 0.1 考马斯亮蓝 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 G-250 试剂 对应的吸光度 A 595 2 共 4 页 《生物化学实验技术》课程作业 根据表 2，以 A 595 为纵坐标， SDS 浓度为横坐标，作图 2。 图2 考马斯亮兰 SDS干扰实验图 ( 参考) 0.5 0.4 5 0.3 9 5 A 0.2 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 SDS浓度 图 2 考马斯亮蓝 SDS 干扰实验 理论上， 十二烷基硫酸钠 (SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰， 随着 SDS 浓度的 增加，其混合液的 595nm 处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。 [结论 ]： 1． 考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为 x mg/ml 。 2． 干扰考马斯亮蓝方法的物质中， SDS 的干扰分析情况。 [干扰实验结果分析 ]： 当溶液中存在一定量的 SDS 后所测得的吸光度比正常值相对减小。 但是随着 SDS 浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。从 SDS 与蛋白质的作用机 理来看， SDS 可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。 SDS 和蛋白质结合后使蛋白质 -SDS 复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基