药品生物检定技术 2.1 管碟法 电子教案-知识点2;管碟法.doc

《药品生物检定》教案 知识点 管碟法 学时 2学时 教学内容 管碟法测定的原理、检定的影响因素、管碟法检定方法与操作流程 教学重点 管碟法检定方法与操作流程 教学难点 管碟法检定的影响因素 管碟法操作流程 参考资料 药品生物检定技术 主编：杨元娟 人民卫生出版社 药品生物检定技术 主编：赵卫峰 中国医药科技出版社 药品生物检定技术（第二版）主编：李榆梅 化学工业出版社 药品生物检定 主编：周海钧 人民卫生出版社 一、检定原理 管碟法，又称杯碟法，是通过将不锈钢小管（俗称为牛津杯）放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱内，使试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度随与小钢管间距离的增大而降低，离小钢管越远，培养基中的抗生素分子越少，相应的抗生素浓度越低。当抗生素分子扩散达到一定时间，可在小钢管周围形成一个抑菌圈。 图11-1抑菌圈生成图 从图11-1和式 (11-2)可以看出，抑菌圈的半径大小与最小抑菌浓度c、琼脂层厚度H、抗生素在琼脂内扩散系数D、抗生素在小钢管中的量M以及抗生素的扩散时间T有关。这些因素的改变会影响抑菌圈的大小和清晰度。故在抗生素效价测定时，为消除各种因素的干扰，采用标准品和供试品在相同试验条件下进行，测得相对效价的比率，再由已知标准品效价计算供试品效价。 管碟法的优点是样品用量少、灵敏度高，但同时专属性较差、操作烦琐、影响因素多。 图11-2 抗生素量-反应直线 …知识链接…… 量反应平行线原理 抗生素微生物检定法是基于量反应平行线原理，即“在量反应指标中，当抗生素浓度的对数剂量与反应呈直线关系，且供试品与标准品的作用性质相同时，供试品与标准品的两条量反应关系曲线相互平行”。 管碟法试验中，在一定剂量范围内，抗生素的对数剂量与其抑菌圈大小呈直线关系，这在理论上决定了（活性）成分相同的抗生素标准品和供试品在一定剂量范围内产生的两条量反应直线平行，符合量反应平行线原理。 二、检定的影响因素 管碟法的原理是以扩散为基础的，所以只要是能影响扩散的因素就能影响测定结果的准确性。从扩散动力学公式可以知道抑菌圈的大小受到扩散系数D、扩散时间r、抗生素总量凹、琼脂层厚度仃及最小抑菌浓度c等因素的影响，在检定中应控制这些因素的影响。另外，管碟法又是以抗生素浓度与抑菌圈直径呈直线关系的平行原理设计的，因此对影响直线的斜率、截距及直线平行性等因素也要加以控制，才能保证检验结果的准确可靠。 （一）抑菌圈质量的控制 1．抑菌圈的形状 实验中抑菌圈常有破裂、不圆、甚至无圈的现象。其原因是多方面的，这些情况的产生主要是由于在滴加抗生素溶液时药液溅出或漏出、毛细滴管碰到钢管；双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染；试验菌菌龄过老；污染杂菌或菌层培养基加菌液时，培养基温度偏高或受热时间过长，使检定菌部分被烫死，这些均会致使抑菌圈不圆整、破裂甚至无圈。稀释抗生素溶液用的缓冲液pH和盐浓度也可影响抑菌圈的圆整。如四环素类抗生素，当缓冲液pH过低或过高，相邻抑菌圈可相互影响而呈椭圆形；氨基苷类抗生素当缓冲液pH过低、盐浓度偏高或标准品与供试品溶液中盐浓度不等时，会出现无抑菌圈或呈向心形、椭圆形抑菌圈。当抑菌圈过大或钢管位置不规则时，相邻圈之间的抗生素浓度超过最低抑菌浓度，而使抑菌圈扩大呈椭圆形等。 2．抑菌圈的大小 抗生素所致抑菌圈的大小(r)不仅受抗生素量多少的影响，而且与抗生素的最低抑菌浓度c、琼脂层厚度日、抗生素在琼脂内扩散系数D、抗生素在小钢管中的量M以及抗生素的扩散时间r等因素有关。当抗生素浓度c不变时，lgM与r2呈直线关系。故钢管中滴加抗生素的量应保持一致准确，包括称量、稀释均匀准确，稀释用的仪器、容器均匀标准。同时小钢管的规格也应一致，内外壁光，两端平齐光滑，壁厚薄均匀一致，质量一致，切面圆整；适时恰当地放置小钢管，防止放置小钢管时重力不一致。抑菌圈的大小还受r值增减的影响，故预先延长抗生素的扩散时间会使抑菌圈变大。操作中若各钢管中加液时间不同，会影响抑菌圈的大小。所以一组双碟加样时，应尽量缩短加液间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以减小误差。 3．抑菌圈边缘的清晰度 抑菌圈边缘的清晰度是影响测量误差的重要因素之一。导致抑菌圈不清晰的原因主要有抑菌圈在形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各种扩散系统交叉；试验菌培养物不纯；不适当地延长培养时间；以及培养基原材料的成分与质量、pH、盐浓度等都有可能影响抑菌圈边缘的清晰度。 （二）标准品