小叶杨铵转运蛋白基因PsAMT1.2功能的研究.pdfVIP

摘要 摘要 氮素是植物核酸、蛋白质、叶绿素等的主要组成部分，在植物生长发育中起 至关重要的作用。NH4+是植物吸收无机氮的主要形式之一，植物对NH4+ 的吸收 和代谢受定位于膜上的铵转运蛋白（Ammonium Transporters ，AMT ）高度介导。 此外，铵转运蛋白可能在一定程度上响应外界非生物胁迫，表达量升高，增强植 物在逆境下对 NH4+ 的吸收与代谢能力，促进叶绿素的积累、光合作用和蛋白质 的合成等，从而维持植物逆境下的正常生长发育与代谢过程。 试验选取我国西北地区耐盐碱、耐瘠薄的杨树种质资源小叶杨研究对象，通 过对小叶杨编码铵转运蛋白的PsAMT1.2 基因功能进行验证，以及对盐胁迫条件 下超表达 PsAMT1.2 基因的转基因杨树生理指标和氮素的积累与代谢进行研究， 阐明了小叶杨PsAMT1.2 基因对盐胁迫的响应以及盐胁迫下对氮素吸收和代谢的 影响，有利于在分子层面上阐明盐胁迫下氮素吸收与代谢的调控机制。主要结果 如下： 1、小叶杨PsAMT1.2 基因在根系中表达。从小叶杨根系中克隆了PsAMT1.2 基因，基因序列长度为1761 bp，编码586 个氨基酸。克隆基因测序结果与毛果 杨PtrAMT1.2 基因序列的相似度达到98%，确定该基因为小叶杨AMT1.2 基因。 分离并克隆了PsAMT1.2 基因启动子序列，获得小叶杨PsAMT1.2 基因启动子片 段长度为1000 bp，与毛果杨基因启动子的同源性为75% 。 2 、在洋葱内表皮细胞中瞬时表达小叶杨PsAMT1.2 基因，发现PsAMT1.2 基 因定位在膜上，说明PsAMT1.2 蛋白在膜上有活性，是膜转运蛋白。将PsAMT1.2 启动子序列连接到启动子缺失并且有 GUS 标签的表达载体上，蘸花法将 PsAMT1.2 基因启动子导入拟南芥，获得包含PsAMT1.2 基因启动子的转基因拟 南芥，GUS 染色转基因拟南芥，结果表明PsAMT1.2 在根系具有转录活性。 3、异源表达PsAMT1.2 基因恢复了高亲和铵转运蛋白缺失酵母31019b 在低 浓度NH4+环境下的生长活性，并且对甲基铵有转运能力，但优先转运NH4+ ；异 源表达 PsAMT1.2 基因的四缺体拟南芥的 NH4+ 吸收曲线符合饱和的 Michaelis-Menten 方程拟合的双回归曲线，米氏常数Km 为80.603±8.019，证实 PsAMT1.2 为高亲和转运蛋白。 4 、获得3 个超表达PsAMT1.2 转基因株系。经过2 1 d 盐处理，测量转基因 杨树生理指标，发现在盐胁迫下超表达PsAMT1.2 基因的杨树较野生型叶绿素含 15 + 15 量、净光合速率和株高差增加。短期 NH4 处理转基因杨树体内相对 N 含量较 I 西北农林科技大学硕士学位论文 野生型显著增加，说明超表达 PsAMT1.2 有利于转基因杨树在盐胁迫下对 NH4+ 的摄取。 5、在盐胁迫下超表达PsAMT1.2 基因的杨树较野生型叶片与根系中NH4+含 量与NO2-含量增加，根系中NO3-含量下降，以及叶片中谷氨酸合成酶和根系中 谷氨酰胺合成酶活性增强，导致转基因杨树较野生型叶片中谷氨酸和根系谷氨酰 胺的积累增加。此外，盐胁迫下超表达PsAMT1.2 基因杨树根系中谷氨酰胺合成 酶基因GS1.3 和叶片中GS1.3 与GS2 ，谷氨酸合成酶基因Fd-GOGAT 表达水平 增加，有利于 NH4+ 的代谢，为后期合成杨树生长所需蛋白质积累充分的底物含 量。 关键词：氮素；铵转运蛋白；PsAMT1.2 ；氮代谢；盐胁迫 II 目 录