分子生物学试验的常见问题与解决专项方案以下所有都转自胡老师的新浪.docVIP

分子生物学试验常见问题和处理方案 以下全部全部转自胡老师新浪博客，和大家分享。 全部文章内容直梯在二楼一、Southern杂交 问题1：电泳后发觉凝胶中DNA扩散，造成结果难以确定，怎样处理这一问题？ 处理方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶立即处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖质量应该很好，尤其是不应含有内切酶，不然有时将使低拷贝数基因杂交结果难以解释。 ? 问题2：传统方法中转膜不完全问题怎样克服？ 处理方案：经典向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至二十四小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,所以,转膜不完全。向下转膜法因为不需在吸水纸上增加重量,凝胶基础不变形；加之吸水纸吸力和水受到重力方向一致,故能够良好地完成DNA转移,它不需要特殊仪器,转移速度较快,转移效率高。 ? 利用地高辛标识探针进行 Southern 杂交时，对于大于15kb DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤能够促进转膜效率, 但脱嘌呤过分可造成分子量相对较小 DNA 被打断成过小片段而难以和尼龙膜结合。假如试验转膜过程中同时含有大于 15kbDNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这么既能够提升大片断 DNA 转移效率，又不会打坏小片段DNA。 ? 另外，等采取琼指糖凝胶直接杂交方法，来处理这一难题：以转基因鼠检测为例，试验步骤以下：1.转基因鼠建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件，建立转基因小鼠。转基因小鼠检测采取剪取鼠尾DNA做Southern进行判定。2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少许电泳检验酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。(3)干胶应立即杂交。先将胶在水中泡一下，以利于操作。(4)将胶放人杂交液(6×SSC、5×Denhardt’S、0.25% SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA)，加人探针，42℃杂交16-20小时。(5)杂交完成后，洗膜8轮，42℃每次15分钟。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗两次，在冰水中浸泡2分钟，以利于盐排出。(6)干燥后按检测试剂盒操作，室温压片0.5-2小时。冲片摄影。使用探针为G-CSF。DNA，探针标识采取Fluorescein-12-dUTP，检测试剂盒为杜邦企业产品，操作按试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶直接杂交方法，很好地处理了微量核酸或低拷贝数转基因检测问题，结果不仅直观，而且特异性好。和常规Southern杂交相比，它所含有优势是，它省略了将DNA进行转膜步骤，从而避免了因转膜不完全所造成DNA量损失，尤其是低拷贝数基因丢失。其次，也使复杂Southern杂交操作程序大大简化。所以，在转基因鼠判定中和微量核酸检测、疾病诊疗中是预防低拷贝数基因漏检一个可行路径。 ? 问题3：在向下转膜法中，怎样提升转膜效率？ 处理方案：1、转移液水平面应略低于凝胶水平面。假如转移液水平面高于凝胶，短时间内会有大量液体聚集在凝胶上，直接从侧面流失；果转移液水平面过分低于凝胶，影响纱布吸水力，转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变形，使吸水纸和滤纸间产生空隙，而降低吸水纸吸水效率，应立即更换吸水纸。3、过夜转移时，立即添加转移液，防吸干。4、样本丰度高时，移时间能够缩短至1小时，此时凝胶上仍可见大分子量DNA残留，当样本丰度低时，以延长转移时间。5、纱布上不要加盖重物，防凝胶受压变薄，响转移效率。 ? 问题4碱转移结束后尼龙膜潮湿不利于保留，且预防长久保留过程中DNA结合不紧密影响杂交效果，应怎样做？ 处理方案：将尼龙膜置于滤纸上干燥片刻，在紫外交联仪中将转有DNA一面向上1J交联4 min，若尼龙膜暂不杂交，可在4℃下保留备用但存放时间不宜超出六个月。 ? 问题5使用碱转移法，将造成杂交后探针去除困难，几乎80%-90%探针难以洗脱，怎样处理这一问题？ 处理方案：将煮沸5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷却至室温,可除去膜上已杂交DNA探针。洗脱后尼龙膜,可反复用于其它探针杂交(最少可耐5轮杂交和洗脱)。 ? BR问题6：Southern杂交中，探针背景高，应怎样处理？ 处理方案：用随机引物法标识探针要想得到最低背景，在向尼龙膜上加pro