实验一细菌的培养.docVIP

分子生物学实验技术 目录 TOC \o 1-5 \h \z HYPERLINK \h \z 细菌培养用胰蛋白月东 10g 细菌培养用酵母提取物 5g NaCI 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0°加入去离子水至总体 积为1L,在15 lbf / in2 （1.034X lOPa）高压下蒸气灭菌20min,即为LB液体培养基。 LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L= （二） 细菌的培养 （1）在液体培养基中培养 1、 过夜培养 ⑴収5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。 ⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单?菌落，接种于培养液中。 ⑶盖好试管，在摇床上以60r/min 度，于37°C过夜培养。 2、 大体积培养 ⑴按1 : 100的比例将过役培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积 的5倍以上。 （2）于37°C,约300r/min剧烈摇动培养。 （2）在固体培养基中培养 细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。 平板划线法分离单菌落 ⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。 ⑵重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整 个平板。 ⑶于37°C培养直至长出单菌落。 实验二质粒DNA的提取 目的 学习碱裂解法捉取质粒的原理 原理 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它 具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传佶息。目前, 质粒己广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。 质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色休DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合 环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解 法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得 率高的优点。英主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离 的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键 也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当 pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体 DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，山于浮力密度不同，染色体DNA与 大分子RNA、蛋白质?SDS复合物等一起沉淀下來而被除去。 试剂与器材 一、试剂 1、 LB液体培养基：胰蛋白J］东10g,酵母提収物5g, NaCl 10g,溶解于1000mL蒸馆冰 中,用NaOH调pH至7.5 o高压灭菌20mino 2、 LB平板培养基：在每1 OOOmL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20mino 3、 溶液 I : 50mmol/L 葡萄糖,lOmmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCl （pH8. 0） 0 4、 溶液 II： 0. 2mol/L NaOH, 1% SDS0 （必须现配） 5、 溶液III：pH4.8的醋酸钾溶液（5mol/L乙酸钾60 mL,冰乙酸11.5mL,水25mL）° 6、 TE 缓冲液（pH 8.0）： 10 mmol/LTris-HCl, linmol/ LEDTAo 7、 无水乙醇和70%乙醇。 二、器材 1、 Eppendorf管、离心管架 2、 10, 100, 1000 ul微量加样器 3、 台式高速离心机 4、 摇床、高压灭菌锅 5、 大肠杆菌DH5 a （含质粒） 操作步骤 一、 培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37°CX24h,然后从平板上挑取 单菌落，接种于5mL液体培养基中，37°CX12ho 二、 提取步骤 1、 将菌液移入1.5ml离心管，8 000 rpmXlmin,倒置于滤纸上，彻底除去残液。 2、 加入100 ul预冷的溶液I,用涡旋震荡器充分悬浮菌体。 3、 加入 4 ul RNase ,室温X2 mirio 4、 加入200 ul溶液II,快速颠倒,温和混匀，冰浴5mino此时溶液应非常粘稠。 5、 加入150 ul预冷的溶液m,温和混匀（此时应有可见沉淀）,冰浴5 mine 6、 12 000 rpmX5mino转移上清液至另一 1. 5ml离心管中。 7、 上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20°CX20min。 8、 12 000 rpmXSmin,彻底除去残液。 9、 加入500 ul 70%乙醇洗DNA沉淀。3 000 rpmXl min,彻底挥发除去乙醇。 10、加入40 ul ddH2O溶解DNA,待用。（或用TE溶解，-20°C保存）。 实