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PCR实验注意事项 1 2020 年 4 月 19 日 文档仅供参考 实 验 中 的 一 些 好 习 惯 加 入 试 剂 之 前 , 把 它 混 匀一 下 , 以 免放 置 时 间 长 了浓 度 不 均 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去 弹 一 定  要 记  着 关  水  浴 箱 ， 切 记  性 切 记 多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高 的 捷 径 了 所 有 的 试 剂 都 自 己 配 ， 出 了 问 题 才 好 找 原 因 防 止 RNA 酶 污 染 的 措 施 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤 6hr 或更 长 时 间 。 塑料器皿可用 0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃 器 具 因 可 被 氯 仿 腐 蚀 ， 故 不 能 使 用 ） 。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇 干燥，再浸泡在 3% H2O2 室温 10min ，然后用 0.1% DEPC 水冲 洗 ， 晾 干 。 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC，在 37℃ 处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22 μm滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤 换 。 设 置 RNA 操 作 专 用 实 验 室 ， 所 有 器 械 等 应 为 专 用 。 2 2020 年 4 月 19 日 文档仅供参考 二 、  常  见 的  RNA  酶 抑 制  剂 1. 焦磷酸二乙酯（  DEPC）：是一种强烈但不彻底的  RNA  酶抑制 剂。它经过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变 性 ， 从 而 抑 制 酶 的 活 性 。 异硫氰酸胍：当前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋 白 中 解 离 出 来 ， 又 对 RNA 酶 有 强 烈 的 变 性 作 用 。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它 和 RNA 酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制 RNA 酶的活 性  。 RNA 酶的蛋白抑制剂（ RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。 RNasin 是 RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，能够 和 多 种 RNA 酶 结 合 ， 使 其 失 活 。 5. 其它：  SDS、尿素、硅藻土等对  RNA  酶也有一定抑制作用。 因为 DEPc不加选择的修饰蛋白质和 RNA，因此在分离和纯化 RNA 过程 中 不 能使 用 ，而 且它 与 一 些 缓冲 液 ( 例 如 Tri) 不能 相 容 在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验 失 败 的 主 要 原 因 是 核 糖 核 酸 酶 （ RNA 酶 ） 的 污 染 。 RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 研究人员造成的污染 RNA 酶最主要的潜在污染源是研究人员的 手 。 因 此 进 行 RNA 实 验 时 应 勤 换 手 套 。 但 DEPC能与胺和巯基反应 ,因而 含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 3 2020 年 4 月 19 日 文档仅供参考 处  理 （ 一  ）  动 植 物  总  RNA  提 取  -Trizol  法 Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细 菌，样品量从几十毫克至几克。用  Trizol  法提取的总  RNA  绝无蛋 白和  DNA  污染。  RNA  可直接用于  Northern  斑点分析，斑点杂 交，  Poly(A)  分离，体外翻译，  RNase  封阻分析和分子克隆。 1、将组织在液  N 中磨成粉末后，再以  50-100mg  组织加入 1ml Trizol 液研磨，注意样品总体积不能超过所用  Trizol  体积的 10%  。 2、研磨液室温放置 5 分钟，然后以每 1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管  15 秒。 3、取上层水相于一新的离心管，按每  mlTrizol  液加  0.5ml  异 丙醇的比例加入异丙醇，室温放置  10 分钟， 1 g  离心  10 分钟。 4、弃去上清液，按每  ml Trizol 液加入至少  1ml  的比例加入 75%  乙 醇 ， 涡 旋 混 匀 ，  4℃ 下  7500