福林(folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验报告完整版.docxVIP

??????????????????????? 料推荐??????????????????? 福林 (Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度 一、原理 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸， 在碱性条件下， 可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物） 。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。 二、实验仪器 分光光度计 ,试管 ,移液管 ,容量瓶，分析天平，烧杯三、实验试剂 1.Folin-酚试剂甲：碱性铜溶液 甲液：取 Na2CO32g 溶于 100ml0.1mol/l 氢氧化钠溶液中 乙液：取 CuSO4.5H2O 晶体 0.5g，溶于 1% 酒石酸钾 100ml。 临用时按甲：乙 =50：1 混合使用。 2.Folin-酚试剂乙：将 10g 钨酸钠、2.5g 钼酸钠、70ml 蒸馏水、5ml85%磷酸继 10ml 浓盐酸置于 150ml 的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏 1 小时，再加入硫酸锂 15g，蒸馏水 5ml 及液溴数滴，开口煮沸 15 分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至100ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用 1mol/l 的 氢氧化钠溶液滴定， 用酚酞作指示剂， 根据滴定结果， 将试剂稀释至 相当于 1mol/L 的酸。 标准蛋白质溶液： 称取 1g 牛（人）血清蛋白片溶于 0.9%氯化钠溶液 中，并稀释至 1000ml 1 ??????????????????????? 料推荐??????????????????? 四、实验步骤 1.标准曲线的绘制 7 支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。 各管加入 1mlFo1in 酚试剂乙后， 立即摇匀，放置 15 分钟后比色， 在 500nm 处记下各管光密度，以 0 号管为对照，以吸光度为纵坐标， 标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线 2.样品测定 准确吸取样液于干燥的试管中， 同样按下表加入试剂， 测出光密度值 后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。 管号 试剂 1 2 样液（ ml ） 1.0 1.0 Folin- 酚试剂甲 5.0 5.0 ml） 室温放置 10 分钟后，再各加 1 毫升 Fo1in 酚试剂乙，立即摇匀， 放置 15 分钟，在 500nm 处测定光密度值。 五、实验结果 2 ??????????????????????? 料推荐??????????????????? 标准曲线的绘制： 蛋白质浓度 0.00 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 吸光度 0.000 0.079 0.215 0.264 0.346 0.450 0.493 则根 据 y=5.5072x=0.325 得 x 为 0.05901， 则样 液 的浓 度 为 0.5901mg/ml. 六、实验结果分析及思考 1、试说明 Folin-酚法的优缺点 该方法较双缩脲法反应灵敏， 与 0.1mg/ml 浓度的蛋白质样品亦可得到很好的显色反应，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。 2、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵敏？ 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂， Folin —酚 B 试剂，以增加显色量， 从而提高了检测蛋白质的灵敏度。 Folin —酚试剂由 A 试剂和 B 试剂组成。A 试剂由碳酸钠，氢氧化钠， 硫酸铜及酒石酸钾钠组成。 蛋白质中的肽键在碱性条件下， 与酒石酸 3 ??????????????????????? 料推荐??????????????????? 钾钠铜盐溶液起作用， 生成紫红色络合物。 B 试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。 由此可见是它们的显色灵敏度不同造成的。 3、Folin 酚法测蛋白质含量为什么要求加入乙试剂后立即混匀？ 第一步相当于双缩脲反应， 在碱性条件下蛋白质中的肽键与 Cu2+ 作用生成络合物；第二步是基于 Folin 试剂 (磷钼酸和磷钨酸试剂 )在碱 性条件下极不稳定， 易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 (呈 蓝色反应 )，因此需要快速混匀 , 继续实验 4