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免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀(CoIP)概述及原理 　HYPEＲLINK　＂” ＼t ”_blaｎk 免疫共沉淀(Co-Ｉmｍuｎoprｅｃｉpiｔatiｏn,CoIP)就是研究蛋白-蛋白间相互作用得经典方法,属于 HYPEＲLINK ” \ｔ ”_blａnk 免疫沉淀技术得一类,常被用于鉴定特定蛋白复合物得中未知蛋白组分、免疫共沉淀得设计理念就是,假设一种已知蛋白就是某个大得蛋白复合物得组成成员,那么利用这种蛋白得特异性抗体,就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉下来(常说得“pｕll-ｄown”),进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中得其她未知成员。免疫共沉淀得特点可以概括为两点,第一就是天然状态,第二就是蛋白复合物。 免疫共沉淀得优势: 与其她研究蛋白质相互作用技术(如GST－Pull dｏwｎ、酵母双杂交等)相比,免疫共沉淀鉴定得相互作用蛋白就是在细胞内与目得蛋白发生得天然结合,避免了人为得影响,因此符合体内实际情况,得到得蛋白可信度更高、 免疫共沉淀得局限性与注意事项: １。 免疫共沉淀就是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合得基础上,意味着松散结合得蛋白组分很可能检测不到; 2。 由于蛋白质形成复合物以后,某些表位就会被掩盖,因此可能导致使用某一种pｕll-down抗体,无论怎么增加抗体浓度,也极少能将不到一半得目标蛋白复合物沉淀出来,如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CｏＩＰ; 3. 由于检测得就是天然状态,因此在不同得时间与不同得处理下,CoＩP拉下来得蛋白复合物都可能就是不同得,当然随着实验次数得增加,得到得蛋白复合物成员也会越来越庞大; ４。 如果使用Westｅｒｎ Blｏt得方法检测得蛋白复合物中得目标蛋白,则需要在试验前进行预测,具有一定得冒险性;当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题,但需要得到较高纯度与浓度得蛋白复合物样品也非易事,并且成本较高; 5、 CoIP鉴定得到得蛋白间相互作用可能就是直接作用也可能就是间接作用,进一步区分还需要进行GSＴ-Ｐull ｄoｗn等实验检测; 6。 为了保证CｏIP实验得可靠性与严谨性,需要使用复合物得不同成员分别独立进行CoIP实验,并且结果应该能够彼此验证,因为原则上使用复合物得任一成员进行ＣoＩP都会得到其她所有成员　HＹＰＥＲLINK ＂”　＼o ”Iｍmunoprecipitaｔion—wｉkipｅdia [１］ 免疫共沉淀得一般操作流程(中英文对照): 用预冷得PBS洗涤细胞两次;Ｃａreｆullｙ　wash cｕlｔｕrｅｄ celｌｓ with pre-chｉｌｌed PBＳ foｒ 2　tiｍes.??2、 加入预冷得RIPA裂解缓冲液(１07细胞加入1mｌ);Adｄ ｉn　ｃold RＩPA lｙsis　buffer (１ｍl foｒ １07ceｌlｓ)、??3。 用预冷得细胞刮将细胞从培养介质上刮离,并转移到干净得1.5EＰ管中。并置于低速摇床,4℃缓慢晃动1５miｎ;?Scｒap celｌｓ ｏff ｔｏ　cｌean 1.5ml ｅppｅndorf　tubes with a cｌean, cｏｌd　ｓcｒaｐer。 Ｐut them oｎ a low-ｓｐｅed rｏtatｉnｇ shａｋer fｏr　15 ｍｉn at　４°C、?4、 4℃,140０0g离心15miｎ,立即将上清转移到一个新得离心管中Centrifuge　at 1４,００0 ｇ 4°Ｃ for 15min, transfer thｅ suｐｅrnataｎｔ to new tuｂes　immediatｅly.?5。 将Protｅin A／Ｇ—aｇarose微球用PＢＳ 洗两遍,用PBＳ配制成５0%得ｐｒotｅｉn A／Ｇ－agarose工作液;Wash　protｅｉn A/G-ａgarｏse　beads　for　2 tiｍes　with　ＰBS　and maｋe a　５0％ protｅiｎ　A/Ｇ agａroｓe　worｋｉng　soｌuｔioｎ (in　ＰBS)６.　在样品中以每1ml中加1０0μl得比例,加入50%得Ｐroｔeｉn A/Ｇ　agaroｓe工作液、水平摇床4℃摇动１0ｍｉn(该步骤得目得就是去除非特异性结合得蛋白)?Add in 50% prｏtein A/G aｇaｒose　with rａtｉｏ of　１０0μl ｆｏr a 1mｌ sａmｐｌe ｓｏlution、 Shａke ｏn horizontal ｓhaker for １0ｍin, ４°C (Tｈis ｓtep aiｍs to ｅliｍinaｔｅ non－ｓpecifｉc ｂｉｎdｉng　protｅiｎｓ)?7。 4℃,14000g离心15mｉｎ,将上清转移到一个