生化实验原理方法.pdf

实验一 猪血中超氧化物歧化酶 (SOD)的分离纯化 及活力测定、同工酶电泳 一、原理 超氧化物岐化酶 SOD广泛存在于生物体内的含 Cu、Zn、Mn、Fe 的金属类酶。 它作为生物体内重要的自由基清除剂， 可以清除体内多余的超氧阴离子， 在防御 生物体氧化损伤方面起着重要作用。 SOD 是一种酸性蛋白，对热、 pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。根据金属 辅基的不同，它可以分为四类，分别为 Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD， 其中最常见是 (CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。 CuZn-S0D 酶蛋白 的分子量约为 3.2 ×104，每个酶分子由 2 个亚基通过非共价键的疏水基相互作 用缔合成二聚体， 每个亚基 ( 肽链 ) 含有铜、锌原子各一个， 活性中心的核心是铜。 SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由 基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。 本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取 SOD硬进行纯化。 酶活力测定可用以下方法： 黄嘌呤氧化酶法、 细胞色素 C 法、肾上腺素自氧化法 亚硝酸法、 NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚自氧化法等。而该实验 SOD 酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定。 酶活性单位定义为 : 在 1ml 的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达 50%时的酶量定义为一个活力单位。 SOD同工酶奠定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显 色法显示。 由于 SOD能够抑制 O2 - 的作用， 因此， 电泳分离 SOD后，凝胶上无 SOD 处显示为蓝色，又 SOD处为无色透明，由此可以鉴定 SOD同工酶酶谱。 二、 操作步骤 1、 SOD提取 取新鲜猪血，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为 3： 1，轻轻搅拌均匀， 4 000r/min 离心 10min，收集红血球。然后用 2 倍体积生 理盐水洗涤， 4 000r/min 离心 10min，弃上清液；重复 2 次，得洗净的血红 球浓稠液。 然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血 30min，再向溶 血液中分别缓慢加入 0.25 倍体积的预冷 95%乙醇和 0.15 倍体积的预冷氯仿， 剧烈搅拌 15min 左右， 4 000r/min 离心 10min，除去变性蛋白沉淀，取清液 0.5mL。过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度），上清液加热到 65℃-70 ℃，保温 15min，然后迅速冷却到室温， 4 000r/min 离心 5min，弃 去沉淀物，收集上清液（样品 2 记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 粗酶液中加入等量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，冰箱中静置 1h，然后 4000r/min 离心 10min，弃去滤液得沉淀。 讲沉淀用丙酮洗两次， 离心收集沉 淀，自然干燥得绿色成品，称重。按 1mg/1mL溶于蒸馏水，备用。 2、SOD酶活性测定 （1）邻苯三酚自氧化速率的测定。 取两支试管按下表加入 25℃预热过的缓冲液 , 然后加入预热过的邻苯三酚 （空白管用 10mmol/L HCl