流式细胞仪原理及操作步骤.docx

流式细胞仪 (FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起 来的一种先进仪器， 已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的 研究和临床常规工作。 其中检测人白细胞表面标志可对白血病、 淋巴瘤作用迅速正确的诊断， 对淋巴细胞群和亚群进行精确分类， 还能分离纯化某一群或亚群细胞。 活细胞免疫荧光技术 是用于 FCM检测的标本准备， 染色后也能在荧光显微镜下进行观察， 在某些实验条件下， 活 细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的 结果。 (一) 原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体， 先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应 抗原结合， 再用荧光标记的第二抗体结合， 根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应 抗原的密度和分布。 ( 二) 操作步骤 制备活性高的细胞悬液 ( 培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法 ) ↓ 用 10％ FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１× 10７／ ml ↓ 取 40μ l 细胞悬液加入预先有特异性 McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加 50μl 1 ∶ 20( 用 DPBS 稀释 ) 灭活正常兔血清 4℃ 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2ml 左右 1000rpm×5min ↓ 弃上清，加入 50μl工作浓度的羊抗鼠 ( 或兔抗鼠 ) 荧光标记物，充分振摇 4℃ 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2ml 左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液 ( 如为 FCM制备标本，一般加入 1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入 100～500μl 固定液 ) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 ( 标本在试管中可保存 5～7 天 ) ( 三 ) 试剂和器材 各种特异性单克隆抗体。 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 10％ FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液 ( 见附录 ) 。 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 ( 四) 注意事项 1. 整个操作在 4℃下进行， 洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN３，上述实验 条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分， 红外碳硫仪以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合， 出现假 阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc 受体，降低和防止非特异性 染色。 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附 : DPBS ( ×10, 贮存液 ) NaCl 80g KCl 2g  蒸馏水加至  1000ml Na２ HPO４  临用时用蒸馏水  1∶ 10  稀释 KH２ PO４ 2g 2. 洗涤液 DPBS 900ml FCS 50ml ( 终浓度 5％ ) 4％ NaN３ 50ml ( 终浓度％ ) 3. 固定液 DPBS 1000ml 葡萄糖 20g ( 终浓度 2％ ) 甲 醛 10ml NaN３ ( 终浓度％ )