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亚能结核分枝杆菌耐药突变（GC—MTB）检测项目开展指南 一 结核分枝杆菌（MTB）耐药突变基因检测实验流程示意图 二实验室建设 1最佳结核分枝杆菌耐药突变基因检测实验室设计平面图 产物分析区PCR扩增区标本制备区 产物分析区 PCR扩增区 标本制备区 试剂准备区 —I缓冲间 — —I 缓冲间 —缓冲间 111——1 *— 走廊 -缓冲间 1 If 卜 工作流向 1) 2) 3) 进入各个匸作区必须遵循严格的单一方向顺序。 4) 4) 进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的丄作服，并同时佩戴 一次性手套。岀工作区之前必须脱去区域特定匚作服及手套。 5）每一个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材（包括微量移液器、离心机、 水浴锅、试管架、一次性手套、移液枪头、离心管及冰箱等），且不同区域的仪 器设备及耗材不能混用。 2实验室环境 1）工作区域必须始终保持清洁整齐 2） 所有实验台面及地面均应保持清洁. 3） 所有实验废料及垃圾使用专用垃圾袋装好后，封口处理。 4） 每次工作前后对丄作台面进行消毒液擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工 作后开启紫外灯进行灭菌。 3实验室制度及人员配备 1） 实验室必须有完整详细的操作规章制度并严格遵守。 2） 操作人员需要一定的专业技术知识和经验。 3） 操作人员需要有强烈的责任感，工作认真细心。 4） 操作人员需要严格遵守MTB耐药突变基因检测工作的标准操作规程。 三实验所需试剂、设备及其功能简介 整个结核分枝杆菌（MMTB）耐药突变基因检测实验山以下三个实验组成：临 床痰样的处理（DNA的提取），基因扩增（PCR）和杂交分析。 1实验所需试剂 名称 用途 备注 裂解液 提取结核菌DNA 配套试剂，室温保存 结核分枝杆菌耐药突变基因 扩增结核分枝杆菌DNA样本 PCR试剂盒 检测试剂盒I （-20dC保存） 结核分枝杆菌耐药突变基因 杂交检测MTB耐药的五个基 杂交试剂盒 检测试剂盒II 因的多个突变位点 （4°C保存） 2实验所需仪器（推荐使用）及功能简介 实验 所需试剂 所需仪器及部分耗材 功能简介 MTB-DNA 提取及加样 裂解液 电磁炉或水浴锅 水浴加热，充分快速的裂解细胞， 使细菌DNA释放。 台式高速离心机 转速要求：3.000 rpm 将有效成分与废液分开 生物安全柜 为实验操作提供一个洁净，安全 的操作环境。 微量移液器 0. 5-10ML , 10-100PL, 100-1000AL （专用） 微量加样和移液 1.5mL离心管（已灭菌）及管架（专 用） 已灭菌移液吸头（与移液器配套） （专用）  旋涡振荡器 转速：2800rpm 悬浮沉淀 工作服及一次性手套（专用） 保护操作人员同时防1匕实验污染 冰箱(-20°C, 4°C) 存放已抽提好的DNA样本 记号笔，计时器等 对不同样本进行编号和计时 MTB - DNA 扩 增 PCR试剂 盒 普通PCR仪 样本DNA在短时间里呈几何级数 增长。 MTB-DNA 膜 芯片杂交 杂交试剂 盒 杂交仪 型号：FINEPCRCombi-H12 参数： 温度范围：约5°C?80°C 控温精度：±0.5C 旋转速度：0?40 rpm 核酸分子杂交 电磁炉或恒温水浴锅 水浴加热，使双链DNA变性成为 单链 微量加样器一套(0.5-10P L, 10-100P L, 100-1000^ L)(专 用) 微量加样和移液 移液吸头（与加样器配套）（已灭 菌，专用） 和移液枪配套使用，量取不同体 积的液体试剂。 冰箱4°C 放置杂交试剂 工作服及一次性手套 保护操作人员同时防1匕实验污染 记号笔及计时器等 对不同样本进行编号及计时 量筒（lOOmL, lOOOmL）,烧杯,移 液管，洗耳球，银子，显色盒，孵 育盒，封口袋，离心管及离心管架 （1.5mL）（专用） 结核分枝杆菌耐药突变基因（GC-MTB）临床检测结果及常见问题解答 1 MTB耐药检测方法有哪些？ 1） MTB耐药检测LT前常规的方法是药敬培养法，但该法操作复杂，耗时长 （需3至4周），且培养困难，容易产生假阴性，以致造成误判和延误 病人的最佳治疗时间。 2） MTB基因水平的检测 ①DNA测序法：对耐药基因的PCR产物进行直接测序，然后与标准敬感株的 DNA片段比较，分析碱基突变的位置和分布。它是LI前检测基因突变最可靠的方 法，但操作烦琐，费用昂贵，一般用该法作为评估其它检测方法的参考。 ② PCR-单链构象多态性（SSCP）分析：与D\A测序技术相比，SSCP更简单 易行，但SSCP只能用于基因突变的筛选，而不能确定突变的部位和性质。因此难 以满足临床研究的需要。 （3）荧光定量PCR分子灯塔法:该方法适用于点突变，检测简便、快速，可 及时获得结果，但所用的多通道荧光定