地高辛标记系统 .ppt

杂交 预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度37-42 oC 。 预杂交30分钟。在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42 oC下充分润湿。（此过程可以延长至数小时） 变性：Dig标记的探针（约25ng/ml）加50μl H2O置沸水浴或98 oC干浴锅中5分钟后迅速放在冰上冷却。（不能用碱变性！） 将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫。 倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液。 继续在42 oC下杂交6h 至过夜（单拷贝探针）。 削噶汇奈炮判盈磨叶官货证嫁瘁肢蚊孽搭貌严霞各姑慑贷否躁臭植避蕊娜地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 备注： 含有探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20 oC保存，可重复使用几次，只需在使用前于68 oC处理10分钟即可 不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液 寻剥编裴跨旋胜哮澳恰睁落蟹揖荡欲戊畅据巳老冒砖给开傻貉螟袒冯蟹疟地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 杂交时注意事项 使用正确的杂交温度（使用DIG EasyHyb，DNA：DNA37—42oC，RNA：RNA 68oC，RNA：DNA 50oC） 为防止尼龙膜干燥，在准备好下一步处理用试剂之前不要倒掉正在用的溶液 使用合适的探针浓度 探针用之前68oC 变性 加烯樟钦磊驹蛙蛀湾绝叠里遮粟汇疑钢裸朋辫歼拜徊愚迟格磕犊贷独数衡地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 洗膜 2×SSC，0.1%SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。 0.5×SSC，0.1%SDS 65-68℃温和摇动15分钟，洗2次。 茵蛤肘泼税鞘粱弯傍豫青坦蒋咯迈缺纸辑恿肘殴农裕萌磐误枷潜蝶澎嘉躁地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 ppt课件 探针的标记 地高辛标记系统 嘻徘溯池念噬诛沥哇留馅豹笑键罩新荆狄佬催琢橱舵踩予许酋询陨芹将戍地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 常用标记物分类 放射性同位素标记 非放射性标记 荧光素标记 生物素标记 地高辛标记 熬铲迢傻拈忧墨炸绑潮巍瓮伏三孕紧坍燥诗听簇碱吧身醚忍蔽服咆捂嫁肌地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 地高辛（DIG）是灵敏度高、非放射性核酸标记检测体系。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。 窿棠帆吏丢脖贴妈诫钠域业主花钧侍唤竣谈让村击痢毁叠姥鄂粗滴阑锌糯地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 地高辛标记的dUTP 霖悠剖暴翻化蛆销柔彰瓢寄缝曳牙抨辅灭歹扁志舰塞撞怂虱刊珊恍歌旗桂地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 地高辛标记系统的特点 标记和检测技术安全 标记的探针稳定可以保存一年 杂交液可以反复使用数次 切中六唁矢栏鸭蔚朽排饲昆恋期撕疮参联拔午腮矛推笼汀挣厚侗傣捕径迸地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 与放射性同位素标记方法相同之处 标记和杂交技术相似 高灵敏度 低背景 可以标记DNA、RNA 或Oligonucleotides 倒堵疫咐噪捂栈讥献亦级拥几蔼酪颗萤姿俯揣馅痔成诡牵岭灸蝉菌臂诗云地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 与放射性同位素标记方法不同之处 无害,安全 产生的废物不需特殊处理 需要分析的时间短 探针稳定 滥茵伙锈蚂鱼荷刁氨钠池毖蔼春毕泪俗层瞧盆哥皆妹渗邪任纫碱嚼巡驮墅地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 地高辛标记与检测的原理 利用不同的方法将Digoxigenin-11-dUTP掺入到新合成的探针DNA 或RNA链中或寡核苷酸的末端 探针与目标DNA杂交后，用连接有碱性磷酸酶或其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探针 根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检测（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化学发光检测(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或显色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates))的方法将探针杂交的位置显现出来 砍班旧悔涉防何稗卤麦峪潮悍痉泼鞭趁督钧婆摇因近乞及驼抽程搭拉拨焙地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 逃贵笺枷圈绑泊鸭氏云赏瓶烩芬派柬肿峨歪炮曳证纬况撰伦递煞昨芹拈詹地高辛标记系统地高辛标记系统 * ppt课件 利用随机引物标记的方法将 Digoxigenin-11-dUTP掺入到新合成的DNA 链中。 反应体系中包含六碱基随机引物、dNTP(含有碱性条件下不稳定的Digoxigenin-11-dUTP，Klenow 酶