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猕猴桃采后冷害木质化特点及其果实抗冷机制研究 猕猴桃果实在低温贮藏过程中普遍发生冷害 , 其主要症状为果肉水渍状和组 织木质化 , 出现不均匀软化 , 继而导致出库后极易遭受病原菌入侵 , 最终腐烂变质 , 造成猕猴桃产业的巨大损失。 本研究在课题组前期对猕猴桃不同品种冷敏性评价 和冷害控制方法等研究的基础上 , 以中华系品种‘红阳’和美味系品种‘徐香’ 果实为试材 , 研究 0℃条件下 , 不同品种和组织之间果实冷害木质化发生的特点 , 依据其症状差异、 组织细胞显微和超微结构、 相关生理生化变化与组织间广泛靶 向代谢组分析 , 结合冷诱导转录因子 CBF家族基因表达模式分析、关键基因筛选 及其抗冷功能验证 , 系统揭示猕猴桃冷害发生的品种和组织差异性 , 以及果实抗 冷的生理生化和分子机制 , 并探讨了 1- 甲基环丙烯 (1-MCP)、茉莉酸甲酯 (MeJA) 和水杨酸甲酯 (MeSA)在控制采后冷害方面的作用。 主要结果如下 :1 、猕猴桃冷害在不同品种和组织之间的表现存在明显差异 , ‘红阳’ 的冷敏性显著高于 ‘徐香’ , 入库 30d 开始发病 , 主要症状为表皮褐变和 皮下果肉木质化。‘徐香’入库 60d 发病 , 主要症状为皮下果肉呈水渍状和果心褐 变及木质化。 分析‘徐香’果肉和果心组织的冷敏性和抗冷性差异发现 , 果肉的冷敏性高 于果心 , 其组织水渍状的形成可能与低温导致的细胞膜结构损伤和胞液外渗有关 ; 果心组织的褐变和木质化是抗冷过程中次生代谢产物积累的结果。 2、木质化是 猕猴桃果实冷害的典型症状 , 其主要发生在皮下果肉 , 果心部和维管束及其周围 组织中。 木质化主要发生在果实的薄壁细胞中 , 是冷藏过程中木质素沿细胞壁逐渐积 累 , 使次生壁加厚 , 最终木质素充填整个细胞形成木粒细胞的结果。 1-MCP能够显 著减轻‘红阳’和‘徐香’的冷害率和冷害指数 , 降低木质素合成关键酶的活性 , 显著减少果肉组织中木质素的积累 , 进而减轻皮下果肉组织木质化 , 但却加重了 ‘徐香’的果心褐变和木质化程度。 3、参考‘红阳’猕猴桃基因组数据库 , 从‘徐香’果实中成功克隆到 6 个冷 诱导转录因子 CBF基因家族成员 AcCBF1、AcCBF2、AcCBF3、 AcCBF4、AcCBF5和 AcCBF6。经序列比对 , 发现它们均具有 CBF基因的结构特点和序列保守区 ; 进化树 聚类分析将其聚类为两类 , 其中 AcCBF1和 AcCBF2聚类为一个分枝 ,AcCBF3、 AcCBF4、 AcCBF5和 AcCBF6聚类为一个分枝。 4、通过分析 6 个 CBF基因的表达特征 , 发现其在不同品种和组织间的表达模 式存在显著差异。在抗冷性较强的‘徐香’中 ,AcCBF1、AcCBF2和 AcCBF4的表 达水平显著高于 ‘红阳’, 且 AcCBF2和 AcCBF4在‘红阳’中的表达量极低 ;AcCBF3 在‘红阳’中的相对表达量略高于‘徐香’ ;AcCBF5和 AcCBF6在两个品种中的 表达差异不显著 ;AcCBF1和 AcCBF2在‘徐香’中的表达量显著高于其他 CBF成 员。 分析 CBF在‘徐香’果肉和果心不同组织中的表达特征 , 发现除 AcCBF4之外 , 其他 5 个 CBF基因在果肉中的相对表达量显著高于果心 , 尤其是 AcCBF2。由此认 为 ,AcCBF1和 AcCBF2可能是参与果实抗冷的关键基因。 5、MeJA和 MeSA处理均能够有效减轻‘徐香’猕猴桃果实冷害的发生 , 延缓 果实硬度的下降和细胞膜透性的增加 , 但 MeSA处理加重了果心组织的褐变 ,MeJA 处理的效果优于 MeSA,有利于提高果实贮藏品质。 分析 MeJA和 MeSA作为信号分 子对 CBF基因的表达调控发现 , 二者对不同组织和不同基因的表达调控模式不 同 ;MeJA提高了 AcCBF1和 AcCBF2在果肉组织中的表达水平 , 整体上下调了 AcCBF1、 AcCBF2、AcCBF4和 AcCBF5在果心组织中的表达 ;MeSA提高了 AcCBF1、 AcCBF2和 AcCBF5在果肉和果心组织中的表达 , 对 AcCBF5的调控效果最显著 , 对 AcCBF4的调控作用不明显。 6、通过猕猴桃 CBF基因家族成员的蛋白序列比对和不同品种和组织间表达 模式的综合分析 , 认为 AcCBF1和 AcCBF2是响应冷诱导进而提高组织抗冷性的关 键基因。通过分析 AcCBF1和 AcCBF2在抗冷和抵御其他非生物胁迫方面的功能发 现 , 过表达 AcCBF1和 AcCBF2均导致拟南芥植株扁平化生长 , 延迟开花 , 叶色加深 ; 二者显著提高了转基因植株抗冷和抗寒、抗旱、抗高盐胁迫的能