猪溶菌酶的重组表达及其增效研究.docxVIP

猪溶菌酶的重组表达及其增效研究 随着食品安全问题的日益突出以及饲用抗生素滥用问题的愈发严重 , 寻找安 全无污染、高效稳定、广谱抗菌且能够规模生产的抗生素替代品已经迫在眉睫。 作为动物机体免疫系统的组成部分 , 溶菌酶是天然的抗生素替代品 , 目前已被普 遍应用在医药、生物科研、食品以及饲料等领域 , 前景非常广阔。 然而 , 作为畜牧行业最重要的成员之一 , 猪还没有专用的溶菌酶产品。 猪溶菌 (Sus scrofa lysozyme,SSL) 作为猪体内抵抗细菌性疾病的重要屏障 , 不仅具备传统 C 型溶菌酶的抗菌功能 , 还能抵抗胃蛋白酶的降解作用 , 是最理想的猪用抗生素替代品。 然而 , 由于 SSL的来源有限 ( 主要通过猪胃组织的提取 ), 加之其抗革兰氏阴性菌的能力较差 , 目前还没其相关应用的报道。 本文利用基因工程的手段 , 通过微生物发酵的方法规模化生产 SSL产品 ; 同时利用胰蛋白酶对 SSL水解结合一定的分离纯化技术 , 获得了可以杀灭革兰氏阴性菌的抗菌肽产品 ; 然后利用基因修饰的方法 , 将 SSL中抗菌肽的作用强化 , 得到了既保留 SSL抗革兰氏阳性菌的性能 , 又可以杀灭革兰氏阴性菌的新型 SSL产品。 此外 , 还对新型 SSL产品的抗菌机理进行了探究 , 为其工业化应用奠定理论 基础。(1) 根据 NCBI网站的基因序列 , 化学合成了 SSL的编码基因 , 并对其进行大 肠杆菌宿主的密码子优化 , 在 BL21(DE3)中成功得到了诱导表达。 在最优的诱导条件 (25 ℃ , 前培养时间 3 h, 利用 0.8 mmol ·L-1 的 IPTG 诱导 8 h) 发酵后 , 通过对包涵体的洗涤、溶解、透析以及浓缩 , 最终获得了 166.91 ± 3.37 mg ·L-1 的 SSL,比酶活力可达 7950.42 ±226.67 U ·mg-1。利用毕赤酵母 X-33(pPICZ αA) 成功地表达了 SSL基因 , 并比较了两种密码子的优化方法对 SSL 基因在毕赤酵母中表达的影响 , 发现“全局随机优化法”对其表达量的提高较为 明显 , 最终获得了 189.28 ± 4.16 mg· L-1 比酶活力为 2845.38 ± 124.19 U ·mg-1 SSL产品 , 总蛋白表达量是原始基因表达量的 2.63 倍 , 而“一对一”优化法对其表达无明显改善。 此外 , 组成型表达载体 pGAPZαA 和蛋白酶缺陷型宿主 SMD1168H均无法达到野生型 ( 诱导表达载体 )X-33(pPICZ αA) 的表达水平。通过亲和层析或 SSL的复性过程 , 结合超滤的纯化方法 , 得到了电泳纯的 SSL产品。 对其酶学性质和抗菌特性进行了研究 , 发现重组 SSL的性质与其理论值基本一致 : 最适反应温度 35℃、最适反应 pH6.0, 说明利用微生物发酵的方法生产 SSL 是切实可行的。而通过对大肠杆菌和毕赤酵母表达系统生产 SSL的过程进行比较 分析 , 发现大肠杆菌表达系统的生产周期更短 , 得到的产品比酶活力更高 , 有助于 对其性质开展进一步研究。 通过对 SSL进行蛋白酶水解 , 产物的 SDS分析以及抗菌活性测定 , 发现 SSL对胃蛋白酶的水解具有抗性 ; 而胰蛋白酶的水解物具有最强的抗革兰氏 阴性菌活性 , 其抗菌系数可达 2.81, 可杀灭 99%以上的测试菌。利用凝胶过滤色谱 和反相分离色谱的分离纯化 , 结合液质联用的分离与鉴定 , 得到了两种对革兰氏 阴性菌具有抗菌活性的肽 , 其氨基酸序列分别为 :G-V-S-L-A-N-W-V-C-L-A-K(LP) A-W-V-A-W-K(SP)。 经化学合成以后进行抗菌谱的测定 , 发现 LP 对革兰氏阴性菌具有抗菌活性 , 但是对革兰氏阳性菌却没有相应的作用 ; 而 SP既可以杀灭革兰氏阴性菌 , 也基本 上保留了 SSL的抗革兰氏阳性菌的能力。 通过圆二色谱 (Circular dichroism,CD) 分析 ,Swiss-modeling 结构模拟以及 AFM检测 , 推测 LP和 SP的作用方式与具备 螺旋 - 回环 - 螺旋 (Helix-loop-helix,HLH) 结构域的抗菌肽类似 : 主要是通过改变 靶细胞细胞膜的通透性来杀死细胞。 但是它们作用的具体方式不同 ,LP 可能是通过地毯式模型的作用方式 , 而 SP 则是可能借助于其α - 螺旋结构在细胞膜上形成孔洞。 (3) 将本研究中分离得到的 抗菌效果较好的抗菌肽 SP的编码基因、含有 SP的 HLH的编码基因以及 SP的六 拷贝的 6SP编码基因分别与 SSL的编码序列的 N 端或 C 端进行融合 , 构建表达载 体后发