酶的分离纯化.ppt

2021/2/6 * ⑴ 早期分离纯化 特点:①粗提取液中物质成份十分复杂。②欲制备的生物大分子浓度很稀。③物理化学性质相近的物质很多。④希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。对所选方法的要求:①要快速、粗放。②能较大地缩小体积。③分辨力不必太高。④负荷能力要大。可选用的方法:吸附;萃取;沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）;离子交换（批量吸附）;亲和层析等。 2021/2/6 * ⑵晚期分离纯化 可选用的方法:吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。 2021/2/6 * 注意的问题: ①盐析后要及时脱盐。②用凝胶过滤时如何缩小上样体积,因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10～1/6,也可以使用串联柱以加大柱床体积。③必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法,例如分级有机溶剂沉淀,分级盐析,连续两次凝胶过滤或离子交换层析等。 2021/2/6 * ④分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接,尽可能减少工序,提高效率。例如吸附不可以放在盐析之后,以免大量盐离子影响吸附效率;离子交换要放在凝胶过滤之前,因为离子交换层析的上样量可以不受限制,只要不超过柱交换容量即可。 ⑤分离纯化后期,目的产物的纯度和浓度都大大提高,此时对于很多敏感的酶极易变性失活,因此操作步骤要连续、紧凑,尽可能在低温下（如在冷室中）进行。⑥得到最终产品后,必要时要立即冰冻干燥,分装并写明标签,－20℃ 或－70℃保存 2021/2/6 * 五、酶的活力测定与纯度测定 1.酶的活力测定与比活性 ——评价提纯方法好坏的指标 总活力的回收率 反映提纯过程中酶活力的损失情况 比活力提高的倍数 反映纯化的效率 在酶纯化的每个阶段,都需要进行上述测定 两者合理安排,但通常不可兼顾,根据具体情况取舍。 2021/2/6 * 2.纯度鉴定: 方法很多,检验是否还有继续纯化的必要 由于酶分子高度复杂,不同方法检验出的结果可能不同 酶纯度要注明:电泳纯、层析纯、HPLC纯。 2021/2/6 * 鉴定依据: 酶分子的大小、形状:超速离心法、凝胶层析等 酶分子的电荷性质:离子交换层析、电泳等 酶分子的化学性质:一级结构测序（N端或C端） 酶分子的溶解度:Northrop分析法 酶分子的抗原性:免疫双扩散、单抗法 2021/2/6 * Northrop分析法 在一定体积溶剂中,一种蛋白质在溶液中溶解的量曲线（X-总蛋白,Y-溶解的蛋白）,有一个折点,斜率先为1,后为零,而如果有几种蛋白,则不同 总蛋白量 上清中的蛋白量 0 2021/2/6 * 用提纯的酶免疫动物,可获多抗,如果酶不均一,可出现不只一条沉淀线 免疫沉淀法 2021/2/6 * 六、酶的保存 主要任务: 维持酶的天然构象 保证酶的催化活性 2021/2/6 * （一）影响酶稳定性的因素 温度: pH值和缓冲液 氧 酶蛋白的浓度和纯度 2021/2/6 * 温度: 一般情况:低温条件（0-4℃）保持活性 很多酶可以冷冻（-20℃）保存 有些酶冷冻保存失活, 如鸡肝线粒体的丙酮酸脱羧酶,兔肌糖原磷酸化酶 可能原因:低温使得亚基间疏水键减弱,相间变化时的机械破坏,溶质冰晶化与蛋白质结合水间相互关系的改变,等等 2021/2/6 * pH值与缓冲液 缓冲液: 在某个区域有缓冲作用,因酶而异 不同缓冲体系的影响 磷酸盐缓冲体系:盐的溶解度对温度有依赖性,低温会造成局部pH的变化,使酶失活 Tris-Cl体系:温度系数大,但是缓冲范围窄,pH7.5以下缓冲能力弱,对某些酶有抑制作用 2021/2/6 * 氧: 部分酶在空气中不稳定,易缓慢失活 巯基保护剂:防止巯基被氧化 嫌气处理:充氮或者充氩保存,等等 2021/2/6 * 酶蛋白浓度和纯度 稳定性:低浓度＜高浓度＜结晶或干粉 低浓度酶液很容易失活,与亚基解离,容器壁吸附和表面变性等有关 许多酶的粗制品比精制品更稳定 碱性磷酸酶: 粗品冻干粉－20℃保存2年以上 精品冻干粉 半年左右 2021/2/6 * （二）酶的各种稳定剂 底物、抑制剂和辅酶 顺乌头酸酶:加柠檬酸 D－氨基酸氧化酶 加:安息香酸钠（竞争性抑制剂） 加:辅酶FAD 酶分子处于局部扭曲状态,结合上述物质,降低能级,趋于稳定 2021/2/6 * -SH基保护剂: 半胱氨酸（Cys）,谷胱甘肽(GSH),β-巯基乙醇（ME),二硫苏糖醇（DTT）等 巯基参与结合、催化底物,组成别构部位,维持高级结构,维持活性 2021/2/6 * 其他: 无机离子、金属盐、有机溶剂、甘油、蔗糖、表面活性剂等等 如:钙离子可以保护α-淀粉酶 20％丙酮