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地中海实蝇幼虫分子鉴定 摘 要 通过对从秘鲁进口的葡萄中截获实蝇类幼虫进 行its区和线粒体coi, ecu, can、ND5基因序列的扩增和测 序，并与GenBank中对应的序列进行比对，结果表明，截获样品 ITs 区序列和地小海实蝇 ceratitis captitata(Wiedemann) 同源 性为 95.16 %(其小 ITSl 为 99.52 %, ITS2 为 86.2 %)，线粒体 COI, ecu, con, ND5基因序列和地中海实蝇 C.capttata 同 源性为100%, 99.9 %, 99.5 %, 99.8 %;基于COI序列构建的 系统发育树中, 幼虫样品和地中海实蝇最为接近。 根据序列分析 和系统发育关系分析的结果, 将截获的实蝇类幼虫鉴定为地中海 实蝇 C.capttata 。 地中海实蝇 Ceratits capitata(Wiedemann) 属双翅目 Diptera 、实蝇科 Tcphdtidac 、蜡实蝇属 Ceratits ,是一种对水 果和蔬菜极具破坏性的危险性有害生物, 它几乎可危害所有对人 类有价值的水果作物, 其成虫在寄主果实的表皮下产卵, 幼虫孵 化后钻蛀入寄主果实内取食、生长,造成果实腐烂,使之不能食 用而失去经济价值。 该虫对水果种植业具有毁灭性的损害, 曾经 使地中海地区一些国家种植的核果受害率高达 100%。其防治费 用相当可观，1986?1991年，6年时间内美国共进行了 10多次 大规模的根除行动,耗资达 1.5 亿美元。因此,针对地中海实蝇 这一高度危险性有害生物,许多国家制订了十分严格的检疫法 规，由此给地中海实蝇分布国家的水果以及农产品出口贸易设置 了很大的技术贸易障碍。 地中海实蝇不仅可以在经济上造成不可 估量的巨大经济损失，而且对出口贸易造成极其深远的不良影 响。 目前，实蝇类害虫的种的鉴定主要依据成虫的形态特征， 而 卵、幼虫、蛹由于其特征差异小，且有些特征在其不同的发育时 期不够稳定，因此依据形态学鉴定方法很难保证鉴定的准确度。 即使地中海实蝇的幼虫能依据形态学进行鉴定， 但很大程度上依 赖鉴定人员丰富的鉴定经验， 这就制约了不同地区相关工作的进 一步开展。 在口岸检疫工作中， 通常要将幼虫培养到成虫再进行 鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达数周， 无法适应实际工作需要。 分子生物学技术在昆虫领域的应用主要集中在系统演化及 分类鉴定两方面。昆虫系统进化的研究，探索了昆虫属、种间的 关系，从分子水平找出其种间特异性差异， 从而为昆虫的分类鉴 定奠定基础。 而通过昆虫分类鉴定和系统进化的研究， 可以为昆 虫发育早期虫态的鉴定提供必要的研究方法。 Taylor 等利用 PCR-RFLP技术可以鉴定保存在酒精中的或针插的从卵到成虫各 发育阶段的嗜人锥蝇样品，方法快速，在 24h 内即可完成。吴佳 教等也利用PCR-RFLP技术快速鉴定我国南方常见的 6种寡毛实 蝇 Bactrocera 。李正西和沈佐锐利用 rDNA-ITS2 序列探讨了赤 眼蜂属 Trichogramma 不同种分子鉴定的可行性。 为了能够准确及时对截获的实蝇幼虫进行鉴定， 我们尝试了 应用分子生物学方法对秘鲁进口葡萄中截获的实蝇幼虫进行鉴 定和初步研究。试验中扩增了幼虫样品 mtDNA部分基因序列和 ITS区序，将样品序列与Gen Ba nk中相近物种序列进行同源性比 对，通过序列分析的方法对截获的实蝇幼虫进行鉴定。 以期开拓 快速准确的地中海实蝇幼虫鉴定方法， 同时也可为探索截获地中 海实蝇的来源地提供遗传学证据。 材料和方法 1． 1 供试实蝇材料 供试实蝇幼虫样品来源于上海出入境检验检疫局 2006年 3 月在秘鲁进口葡萄中截获的虫样， 样品浸泡于无水乙醇并置于－ 20C冰箱中储存，编号为 PU-］。 1. 2 DNA提取 取截获的实蝇幼虫 1 条放人研钵，加入液氮，磨成粉末状， 用 DNeasyRTissue Kit(Qiagen 公司) 提取样品 DNA。 1 . 3 引物设计 根据 Gen Ba nk 中地中海实蝇 C.capitataAFI89691 ,AJ242872 和油橄榄实蝇 Bactroceraoleae AY210702 , AY210703等实蝇的 ITS 和 mtDNA序列，分别设计了扩增 ITS 区(CFl/CRl , CF6/CR5)、 COI (FC02/RC04)、CCE (F1/F4)、CCE (F32/F35)和 ND5(F13/R12) 的引物，引物由上海生工合成 (表 1)。 1. 4 PCR扩增 PCF反应体系总体积为 30卩L,包含：10mmoI/L Tris-HCI : 50 mmol/L KCl ；2.5 mmol/LMgCl2