基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术.docVIP

用沪乂洋实验报告 专业: 姓名: 学号: 日期：2014.12.17 地点： 课程名称：分子医学实验 指导老师：俞萍应李强成绩： 实验名称：基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术 同组学生姓名: 二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验H的和要求 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤六、实验结果和分析 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 一、 实验目的 了解基因表达检测的相关实验技术和蛋白卬迹技术的原理 学习掌握基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术的方法 二、 实验内容和原理 又称免疫印迹技术和western印迹技术，是鉴别蛋白质的分了杂交技术。 原理：将经过SDS分离的蛋白质样品转移到固相载体上。以网相载体上蛋白质 或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应。 经过底物显色、化学发光或放射自显影，检测特异基因表达的蛋白成分的存在和含量。该 技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的蛋白质的生物学活性不 变。转膜方式以电转移最为常用，I舌I相载体主要有：硝酸纤维素薄膜：结合蛋H的能力为 100ug/cm2,机械强度较低。PVDF膜：具有很好的结合蛋白质的能力(200ug/cm2),且 机械性能强，结合在膜上的蛋白质可以育接进行序列分析，具有较好的染色和检测的兼容 性。木实验使用PVDF膜。 Western blotting蛋白显影方法 放射自显影 底物化学发光ECL 底物荧光ECF 底物DAB （3,3二氨基联苯胺）呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。 增强化学发光法（ECL） Ecl显色原理：爼基苯二酰月井类：主要是鲁米诺（luminol）及异鲁米诺衍生物，是最常用 的一类化学发光剂。在Ecl底物中，含有鲁米诺（溶液A）和H2O2 （溶液B）,在HRP （辣根过氧化物酶）催化剂的作用下，发出荧光來。HRP不消耗。 注意：荧光在一段时间后会越來越弱。 2.DAB显色 DAB （3,3二氮基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精 和其它有机溶剂，对于必需使川复染和免疫组化染色特别理想。对于碱性磷酸酶（AP）标 记的二抗，则选用BCIP和NBT显色，在AP作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的 强信号。 三、 实验器材和材料 实验试剂：分离胶缓冲溶液、单体交联剂、催化剂、2%四中基乙二胺、浓缩胶缓冲溶液、 电极缓冲溶液、样品缓冲液、转膜缓冲液、1*TBST溶液、标准相对分了质量蛋H、封闭 液、ECL化学发光液A、Bo 实验器材：电泳装置和电转移装置、恒温水浴摇床。 四、 实验内容和程序 前面步骤与实验3—致，SDS 封闭：取出4度存放的PVDF膜,TBST润湿,根据蛋marker,用剪取36-37KD范围的 PVDF膜（H的蛋ft GAPDII所在的范围），放到小的培养111L中，加入封闭液，将膜浸没， 室温摇床轻摇lh。TBST漂洗 —抗反应：加入一抗（1： 10000稀释）2 ml到反应盒屮，将PVDF膜放入盒屮，使抗体 浸没膜，室温lh。 洗涤：将膜取出放入小培养血屮，用1 x TBST漂洗PVDF膜3次，每次lOmin 二抗反应：加入二抗（1： 3000稀释）2ml到反应盒屮，将PVDF膜放入盒屮，使抗体浸 没膜，室温lh。 洗膜：将膜取出放入小培养血屮，用1 xTBST漂洗PVDF膜3次，每次lOmin； 检测：将PVDF膜上加ECL化学发光液（A、B液0. 5ml等量混合），反应lmin后，化 学发光检测仪上观察并记录实验结果。 五、 实验结果与分析 木次实验曝光无结果，并且全班同学的样品均无结果（没有条带）。但是由于PVDF膜 上有呃rk的条带，说明转膜Z前的步骤都退是成功的，那么可能的原因是出在转膜Z后。 可能原因如下： 曝光液有问题，可能以前混合过，导致该液体作废，无ECL反应。 —抗或者二抗在配叠过程中出现问题，或者配置时间过久，或因为没有在低温下保存导 致其失活。使得目标蛋白没有和一抗、二抗正确锚定。 转膜Z后间隔一段时间保存示才开始后续实验，可能是在低温保存PVDF膜时出现差错， 导致膜上蛋白变性，使之无法与一抗结合。 曝光液A、B混合Z后时间过长才开始曝光。由于荧光淬灭时间很短，导致无结果。 六、实验讨论与心得 木次实验非常失败，可能原因已经分析。除此Z外，可能造成实验失败，需要特别注意的 一些细节如下： SDS见实验报告3 转膜时一定要注意三明治结构屮不能存在气泡，否则气泡附近蛋白将无法转到膜上。 转膜要在低温条件下进行，防止转膜电流过高发热导致蛋H变性。 封闭、敷一抗、二抗时一定要确保膜在摇床条件下浸没在液体屮。 TBS